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      質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選結(jié)直腸癌外周血單個核細(xì)胞差異表達(dá)蛋白

      2018-04-02 02:37:22逄雪超紀(jì)麗云
      質(zhì)譜學(xué)報 2018年2期
      關(guān)鍵詞:外周血定量直腸癌

      逄雪超,徐 燕,紀(jì)麗云

      (上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院,上?!?00240)

      結(jié)直腸癌是一種發(fā)于結(jié)腸或者直腸的癌癥,屬于消化系統(tǒng),又稱為胃腸消化道癌癥,是世界高發(fā)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計,2015年發(fā)展中國家新增病例超過77.7萬例,死亡人數(shù)達(dá)35萬人[1]。結(jié)直腸癌(CRC)早期治療生存率高,但由于缺乏足夠特異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物,大多數(shù)患者在結(jié)直腸癌晚期才被確診,延誤了最佳治療時間。在組織癌變過程中,機體的免疫系統(tǒng)功能極有可能受到CRC發(fā)生、發(fā)展的影響,產(chǎn)生相應(yīng)的變化。外周血單個核細(xì)胞(PBMC)作為免疫系統(tǒng)的重要組分,包括單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞,是研究免疫變化的理想材料。近年來,大量研究表明,癌癥的發(fā)生、發(fā)展與PBMC息息相關(guān)[2-3]。

      為了找到CRC患者PBMC中的差異表達(dá)蛋白,以及研究CRC的發(fā)生對免疫系統(tǒng)的影響,本研究擬采用最新的經(jīng)典數(shù)據(jù)非依賴性質(zhì)譜掃描技術(shù)(DIA),將整個MS1的掃描范圍等分為若干窗口,每個窗口依次選擇、碎裂、采集窗口內(nèi)所有母離子的全部子離子信息。運用Skyline軟件對DIA的采集結(jié)果進(jìn)行處理,以實現(xiàn)蛋白的定量分析,并比較結(jié)直腸癌患者與良性腸病患者PBMC蛋白的差異表達(dá),以期找到CRC的早期標(biāo)志物并闡明PBMC的變化,為CRC的診斷或免疫治療奠定基礎(chǔ)。

      1 實驗部分

      1.1 儀器

      QE-plus質(zhì)譜儀、EASY-nLC-1000 UPLC納升液相色譜儀、-80 ℃超低溫冰箱、低溫離心機:均為美國Thermo公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀:美國Bio-Tek公司產(chǎn)品;Newclassic MF分析天平:瑞士Mettler-Toledo公司產(chǎn)品;除鹽系統(tǒng):美國Supelco公司產(chǎn)品。

      1.2 試劑

      碳酸氫銨、氫氧化鈉、尿素、氯化銨、氯化鈣、碘乙酰胺:均為化學(xué)純,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;甲酸(FA):德國CNW公司產(chǎn)品;酸不穩(wěn)定表面活性劑(ALS):美國系統(tǒng)生物研究所產(chǎn)品;TCEP(tris(2-carboxyethyl) phosphine):美國Fluka公司產(chǎn)品;HEPES(tris-(2-carboxyethyl) phosphine):生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;乙腈(ACN):美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品;蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tablets):德國Roche公司產(chǎn)品。

      1.3 病例信息

      收集2016年3月至4月上海新華醫(yī)院樣本11例,其中6例結(jié)直腸癌患者術(shù)前樣本,5例腸道其他疾病(非瘤或良性瘤)樣本。取血后4 h內(nèi)用人類淋巴細(xì)胞分離管收集PBMC,于-80 ℃保存,備用。

      1.4 樣品準(zhǔn)備

      1.4.1細(xì)胞裂解將200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(0.2%ALS,20 mmol/L HEPES,1X蛋白酶抑制劑)加入裝有PBMC的EP管中,吹散細(xì)胞并在冰上振蕩裂解25 min,低溫4 ℃,以13 000 r/min離心20 min,取上清液,于-80 ℃保存,備用。

      1.4.2蛋白酶解采用蛋白濃度測定試劑盒(BCA)法確定蛋白質(zhì)濃度后,取30 μg蛋白,在37 ℃下,6 mol/L尿素中變性30 min;在5 mmol/L TCEP中還原,55 ℃下反應(yīng)30 min;加入碘乙酰胺(IAA)使終濃度為6.25 mmol/L,室溫下避光反應(yīng)1 h。用6倍樣品體積的50 mmol/L AMBIC稀釋,使尿素濃度低于1 mol/L。加入CaCl2使終濃度為1 mmol/L,用NaOH調(diào)至pH 8;加胰酶(胰酶質(zhì)量∶蛋白質(zhì)量= 1∶100),于37 ℃過夜反應(yīng)16 h。用C18填料的96孔除鹽柱除鹽,冷凍離心機干燥,于-20 ℃保存,等待上樣。

      1.5 數(shù)據(jù)采集

      1.5.1譜圖庫的建立采用數(shù)據(jù)依賴性(DDA)模式對11個樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,每份樣品采用Easy-LC 1000 UPLC串聯(lián)Q-Exactive Plus進(jìn)行分離和檢測,上樣量1 μg。流動相:A相為0.1%FA-H2O,B相為0.1%FA-80%ACN;洗脫梯度:0~5 min(3%~7%B),5~55 min(7%~22%B),55~65 min(22%~35%B),65~68 min(35%~80%B),68~75 min(80%B)。正離子掃描模式,質(zhì)量掃描范圍m/z400~1 200。DDA數(shù)據(jù)采用Trans-Proteomic Pipeline(TPP) 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索,數(shù)據(jù)庫為Uniport非冗余庫(2 014.9),胰酶漏切位點設(shè)為0;固定修飾半胱氨酸烷基化(57.021 46 u),非固定修飾甲硫氨酸氧化(15.994 9 u);母離子誤差范圍控制在10-5內(nèi),二級碎片誤差控制在0.02 u內(nèi)。用TPP將11個搜庫結(jié)果整合建庫導(dǎo)入Skyline,用于DIA的數(shù)據(jù)分析。

      1.5.2DIA-MS數(shù)據(jù)獲取及處理采用與DDA采集一致的液相分離梯度,對11個樣本進(jìn)行DIA數(shù)據(jù)采集,將質(zhì)量掃描范圍m/z400~1 200等分成32個連續(xù)的25 u窗口,每個窗口內(nèi)依次選擇、碎裂、采集所有母離子的全部子離子信息用于定量,重復(fù)2次。采用Skyline(Skyline-daily 3.5.1.9283)軟件進(jìn)行非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。將DIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入,進(jìn)行蛋白定量信息的篩選和提取。采用Skyline自動輔助功能篩選合適的色譜峰,方法參考Skyline官網(wǎng)數(shù)據(jù)非依賴采集數(shù)據(jù)處理教程,只考慮+1和+2價子離子,用肽段特征碎片離子提取面積之和對肽段進(jìn)行定量,導(dǎo)出包含蛋白名稱、多肽序列及子離子面積的信息。

      采用R(version 3.2.2)軟件對兩次DIA定量數(shù)據(jù)用總離子強度(TIC)進(jìn)行歸一化處理,取兩次結(jié)果的平均值用于后續(xù)分析。分別刪除癌癥組和對照組中樣本間超過20%的子離子定量信息為0的子離子,保留兩組樣本中子離子定量相關(guān)性大于0.6的肽段。將同一肽段子離子面積加和歸到肽段水平,在肽段水平進(jìn)行雙尾t檢驗,篩選具有顯著差異的肽段(p<0.05),然后歸到蛋白水平,找到差異表達(dá)蛋白。

      DAVID是一個旨在從大批量的基因數(shù)據(jù)或蛋白數(shù)據(jù)中系統(tǒng)提取生物信息,整合完整生物數(shù)據(jù)的分析工具[4]。它是研究蛋白質(zhì)功能及生物信號通路的有力手段,應(yīng)用DAVID從蛋白質(zhì)的生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)3個方面分別對上調(diào)和下調(diào)的蛋白進(jìn)行基因富集分析,分類嚴(yán)格等級設(shè)為高。使用Reactome對上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白做通路分析。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 差異蛋白分析

      11個樣本DDA數(shù)據(jù)建庫,共得到11 657條肽,2 585個蛋白,其中用Skyline軟件定量到760個蛋白。對定量到的760個蛋白進(jìn)行t檢驗,共得到113個差異蛋白(p<0.05),其中結(jié)直腸癌癥組相比于良性結(jié)直腸疾病組,包含上調(diào)差異蛋白23個,下調(diào)差異蛋白90個。用這些差異蛋白聚類分析可以將結(jié)直腸癌組與良性結(jié)直腸疾病組明顯的分成兩類,示于圖1。然后進(jìn)行GO聚類分析,采用Benjamini校正法校正p值,導(dǎo)出校正后p<0.05的結(jié)果進(jìn)一步探究。細(xì)胞組分分析結(jié)果顯示,下調(diào)蛋白多為胞外組分,包括胞外外泌體、胞外膜結(jié)構(gòu)、胞外囊泡和胞外體等;生物過程分析顯示,下調(diào)差異蛋白主要參與的生物過程有血小板脫顆粒、調(diào)控細(xì)胞外泌、胞外分泌、囊泡調(diào)控的轉(zhuǎn)運過程及細(xì)胞分泌過程等;分子功能分析結(jié)果顯示,下調(diào)的差異蛋白多與細(xì)胞黏附、胞間粘著、鈣粘蛋白參與的細(xì)胞間黏附等作用有關(guān)。這些結(jié)果表明,癌癥患者的外周單核細(xì)胞的蛋白合成、蛋白分泌等可能發(fā)生了變化;并且細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可能發(fā)生了變化,暗示著免疫細(xì)胞及免疫系統(tǒng)受到了調(diào)控。上調(diào)蛋白GO聚類分析結(jié)果經(jīng)校正后p值均大于0.05。用Reactome對差異蛋白做通路分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)差異蛋白主要涉及SRP-依賴的翻譯蛋白靶向膜通路;而下調(diào)差異蛋白涉及通路主要包括MAP2K和MAPK激活、一系列整合素相關(guān)通路、纖維蛋白凝血通路、RHOGTPase激活PAKs 及激活PKNs通路,其結(jié)果列于表1。

      2.2 差異蛋白中與免疫直接相關(guān)的蛋白

      本研究共篩選出113個差異蛋白(p<0.05),其中差異倍數(shù)≥2的差異蛋白67個,上調(diào)蛋白23個,下調(diào)蛋白44個,分別列于表2和表3。在發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白中,Galectin-1、Dok-2、AHNAK1等蛋白與機體的免疫功能息息相關(guān),它們參與巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞等多種外周免疫細(xì)胞的免疫活動。

      Galectin-1(P09382, LEG1)是最早發(fā)現(xiàn)的Gal家族二聚體分子[5],在免疫系統(tǒng)中,Gal一般存在于激活的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞以及T細(xì)胞[6-8]中。隨著各種生物技術(shù)的發(fā)展,越來越多的研究證明這種內(nèi)源性的凝集素是一種非常重要的調(diào)節(jié)固有及獲得性免疫的調(diào)控分子[9-14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌癥患者的外周血單個核細(xì)胞中,Galectin-1蛋白發(fā)生了極其顯著的高表達(dá)現(xiàn)象,說明患者體內(nèi)免疫細(xì)胞被激活,即在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中,機體可能發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。Rabinovich等[9]研究證明,Galectin-1在人類的單核細(xì)胞中可以通過觸發(fā)MAPK中ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生理機能,從而影響機體的固有免疫和獲得性免疫功能。這些研究都說明,該蛋白過表達(dá)與機體免疫息息相關(guān),結(jié)合本研究的信號通路分析結(jié)果,差異蛋白被富集到MAPK通路,暗示在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中,PBMC中Galectin-1蛋白發(fā)生顯著變化的分子原理,Galectin-1很有可能成為CRC的分子標(biāo)志物。

      Dok-2(O60496, DOK2)是DOK(downstream of tyrosine kinase)家族成員,目前已發(fā)現(xiàn)該家族包含7個蛋白[15],在眾多免疫細(xì)胞中,Dok-2蛋白多在T細(xì)胞及髓系細(xì)胞中表達(dá)[16-17],大量研究報道Dok-2蛋白與Dok-1蛋白共同作用負(fù)調(diào)控T細(xì)胞的免疫活動[16,18-19]。同時,Yamanashi等[20]通過測定敲除Dok-1和Dok-2基因的小鼠活化巨噬細(xì)胞分泌物,證明了Dok-1和Dok-2蛋白在巨噬細(xì)胞的TLR4信號活動中起負(fù)調(diào)控作用,從而推測其可能影響機體的固有免疫功能。結(jié)合本實驗該蛋白在癌癥組明顯下調(diào)的結(jié)果,說明在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中,免疫細(xì)胞可能做出了免疫響應(yīng)以應(yīng)對癌癥的發(fā)生,Dok-2蛋白在結(jié)直腸癌患者的PBMC中明顯低表達(dá),其有望成為結(jié)直腸癌患者外周血單個核細(xì)胞中的診斷標(biāo)志物。

      注:CA代表蛋白結(jié)直腸癌患者;NA代表良性腸類疾病患者圖1 113個差異蛋白聚類分析Fig.1 Unsupervised hierarchical clustering of 113 differentially expressed proteins

      通路序號PathwayID名稱Name數(shù)目Count百分比Percent/%校正后結(jié)果BenjaminiDown-regulatedR-HSA-114608Plateletdegranulation2122.111.895×10-20R-HSA-5674135MAP2KandMAPKactivation88.422.459×10-6R-HSA-354194GRB2:SOSprovideslinkagetoMAPKsignalingforintegrins66.325.587×10-6R-HSA-372708P130CaslinkagetoMAPKsignalingforintegrins66.325.587×10-6R-HSA-354192IntegrinalphaIIbbeta3signaling66.324.467×10-5R-HSA-140875Commonpathwayoffibrinclotformation55.260.0010291R-HSA-216083Integrincellsurfaceinteractions66.320.0206406R-HSA-5627123RHOGTPasesactivatePAKs44.210.0258562R-HSA-5625740RHOGTPasesactivatePKNs44.210.0356186Up-regulatedR-HSA-1799339SRP-dependentcotranslationalproteintargetingtomembrane422.200.034

      表2 結(jié)直腸癌患者外周血單個核細(xì)胞上調(diào)蛋白Table 2 Up regulated proteins in PBMC of CRC

      AHNAK1(Q09666, AHNK)是一個分子質(zhì)量接近700 u的蛋白,在CD4+T細(xì)胞中高表達(dá),參與調(diào)控Ca2+-calcineurin-NFAT信號通路[21],是該通路中的重要組分,該信號通路調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活、增殖以及細(xì)胞因子的分泌等免疫活動[22]。Matza等[21]研究表明,鈣離子信號通路對于T細(xì)胞的激活發(fā)揮了重要作用。為研究該蛋白對T細(xì)胞功能的影響,對比了AHNAK1基因敲除鼠和普通小鼠在發(fā)生感染時,CD4+T細(xì)胞的IFN-γ分泌情況,發(fā)現(xiàn)AHNAK1基因敲除鼠IFN-γ的分泌受到了嚴(yán)重?fù)p害,這表明AHNAK1蛋白對Th1免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用,這是因為Th1的免疫應(yīng)答主要是通過分泌IFN-γ來發(fā)揮作用的。結(jié)合本研究癌癥組AHNAK1蛋白低表達(dá)的結(jié)果,推測癌癥組T細(xì)胞Th1活性可能受到了抑制,AHNAK1具有成為結(jié)直腸癌標(biāo)志物的潛力。

      表3 結(jié)直腸癌患者外周血單個核細(xì)胞下調(diào)蛋白Table 3 Down regulated proteins in PBMC of CRC

      3 結(jié)論

      目前,LC/MS已成為復(fù)雜樣本中通量分析蛋白和小分子的主流工具[23]。本研究采用的DIA-MS定量技術(shù)相比于DDA相對定量技術(shù)及MRM-MS定量技術(shù),無需指定目標(biāo)肽段、通量無上限、掃描點數(shù)均勻,可獲得固定質(zhì)量范圍內(nèi)母離子的全部子離子信息,利用譜圖庫即可實現(xiàn)定性確證和定量離子篩選,同時可實現(xiàn)數(shù)據(jù)隨時回溯和生物樣本信息數(shù)字化[24-25]。但DIA數(shù)據(jù)采集亦有一定的局限性,比如:難以使用超高分辨率掃描模式、大窗口引入較大干擾、依賴DDA形成的譜圖庫才能實現(xiàn)蛋白的定性、定量[24,26]。本研究在Q-Exactive plus平臺上完成了經(jīng)典DIA數(shù)據(jù)采集,借助Skyline軟件完成了通量蛋白的定量,并找到一系列結(jié)直腸癌患者外周血單個核細(xì)胞差異蛋白。結(jié)直腸癌的形成是一個長期的先天與后天、機體與內(nèi)分泌相互作用的復(fù)雜過程[27]。在這個復(fù)雜而漫長的疾病發(fā)生發(fā)展過程中,機體的很多方面發(fā)生了變化,包括基因、代謝、蛋白等。因此,理解結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機制對于診斷和治療該疾病具有重要的意義[28]。當(dāng)癌癥發(fā)生時,機體的免疫系統(tǒng)會因為識別癌變或癌癥入侵免疫系統(tǒng)而發(fā)生變化。近年來,許多研究證實,當(dāng)惡性腫瘤或惡性疾病發(fā)生時,機體的PBMC會發(fā)生顯著變化,包括基因組[29]、轉(zhuǎn)錄組[3]、蛋白組[30]等,但對癌癥發(fā)生時的PBMC蛋白組研究未見報道。因此,本實驗采用DIA蛋白定量方法對結(jié)直腸癌患者外周血單個核細(xì)胞蛋白進(jìn)行初步探究,篩選得到一批在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生顯著變化的蛋白,這些蛋白有望成為CRC的疾病診斷標(biāo)志物或癌癥免疫治療的靶點,但這仍需要進(jìn)一步的大樣本分析驗證、靶向定量或生物學(xué)驗證。并應(yīng)用DIA-MS在外周血單核細(xì)胞中尋找到CRC與非惡性腸病的差異表達(dá)蛋白,可以基于以上結(jié)果進(jìn)行后續(xù)研究。同時,隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,譜圖庫更加完整,DIA數(shù)據(jù)可隨時被回溯分析,從歷史樣本中可分析得到新的有價值的信息。

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