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(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科 上海 200032; 2上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)是一種由原發(fā)腫瘤組織脫落入血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[1]。CTCs進(jìn)入血液循環(huán)后,絕大部分經(jīng)脫巢凋亡(anoikis)、血流剪應(yīng)力和機(jī)體免疫識(shí)別殺傷,最終能在外周血中存活的CTCs數(shù)量很少,通常為1～102/mL(白細(xì)胞數(shù)量為105～106/mL,紅細(xì)胞數(shù)量為109～1010/mL)。目前研究認(rèn)為,CTCs和多個(gè)CTCs形成的團(tuán)簇在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用[2]。CTCs在傳播過(guò)程中的表面抗原、基因型及其病理學(xué)表征是當(dāng)前癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究要點(diǎn)。以CTCs技術(shù)為代表的“液體活檢”取樣簡(jiǎn)易且微創(chuàng),能更好地代表腫瘤的異質(zhì)性,已被視為一種新型的腫瘤生物標(biāo)記物。CTCs計(jì)數(shù)、計(jì)數(shù)變化、亞群特征等與患者預(yù)后密切相關(guān),并與個(gè)體化治療建立起越來(lái)越多的聯(lián)系。利用CTCs的功能性診斷結(jié)果建立個(gè)性化癌癥治療方案,是實(shí)現(xiàn)癌癥精準(zhǔn)用藥重要而可靠的途徑。本文就CTCs的研究進(jìn)展及其在胰腺癌診療中的應(yīng)用作一綜述。

CTCs的分離CTCs的分離方法按照分離原理可以分為生物法和物理法兩大類[3]。生物法利用CTCs不同于其他血細(xì)胞(白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板)的表面抗原,物理方法則根據(jù)CTCs與其他血細(xì)胞在密度、尺寸、變形性方面的差異。將患者血樣中的紅細(xì)胞裂解后,采用表面固定的EpCAM抗體直接識(shí)別并捕獲表達(dá)EpCAM抗原的CTCs,獲得的CTCs即可進(jìn)行顯色分析,這種分離方法屬于生物法中的陽(yáng)性富集。CellSearch系統(tǒng)是這一分離技術(shù)的代表,是目前唯一經(jīng)FDA認(rèn)準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌預(yù)后判斷的CTCs分離系統(tǒng)[4-6]。使用表面帶有白細(xì)胞特異性抗體的磁珠吸附白細(xì)胞,獲得未標(biāo)記的CTCs懸浮液,這種方法又稱為生物法中的陰性富集[7]。物理法中,OncoQuick系統(tǒng)不依賴抗原的識(shí)別,而是通過(guò)CTCs和其他血細(xì)胞的密度不同加以分離,因此可以獲得EpCAM陽(yáng)性和陰性的CTCs[8]。MetaCell系統(tǒng)的技術(shù)核心是利用CTCs的直徑大于其他血細(xì)胞的特點(diǎn),將血樣通過(guò)孔徑為8 μm的聚碳酸脂膜,過(guò)濾分離CTCs[9]。Hou等[10]根據(jù)流體力學(xué)原理設(shè)計(jì)了螺旋形微管道,通過(guò)慣性微流與Dean環(huán)流的耦合分離CTCs與白細(xì)胞。Yeo等[11]在這一基礎(chǔ)上,進(jìn)一步設(shè)計(jì)了能分離出單個(gè)CTC的微流控設(shè)備,使獲得的CTCs可以直接用于下游分子生物學(xué)檢測(cè)。目前,也有納米技術(shù)應(yīng)用于CTCs分離的報(bào)道。Halo等[12]將與CTCs中特定基因(如TWIST) mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA附著于金納米顆粒表面,當(dāng)納米顆粒進(jìn)入CTCs時(shí),兩者結(jié)合時(shí)釋放熒光,根據(jù)熒光強(qiáng)度可半定量檢測(cè)CTCs。需要注意的是,不同原理、不同的分離體系的CTCs檢出率和純度會(huì)相差很大。如Kaifi等[13]的研究中,同時(shí)使用基于抗原的CellSearch系統(tǒng)和基于尺寸的FMSA系統(tǒng)分別檢測(cè)圍術(shù)期CTCs時(shí),FMSA系統(tǒng)的檢測(cè)率高達(dá)93.4%,CTCs平均數(shù)為22.56個(gè)/7.5 mL,而CellSearch系統(tǒng)僅為26.1%和0.87個(gè)/7.5 mL。基于抗原識(shí)別的生物方法具有高純度的優(yōu)勢(shì),但會(huì)遺漏不表達(dá)相應(yīng)抗原的CTCs,而且因抗原抗體的作用,有可能影響下游功能檢測(cè);基于密度和尺寸的物理分離方法,不受CTCs表面抗原表達(dá)的影響,檢出率較高,但因可能混雜其他血細(xì)胞而導(dǎo)致純度較低。CTCs分離技術(shù)發(fā)展很快,很多較成熟的體系已經(jīng)具備較快的樣品處理速度和較高的檢出率、檢出純度。目前急需的是相應(yīng)的技術(shù)規(guī)范和操作標(biāo)準(zhǔn),以便臨床應(yīng)用研究和實(shí)驗(yàn)研究的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。

CTCs的分子生物學(xué)特征隨著CTCs分離技術(shù)的不斷改良,基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等生物學(xué)成果的涌現(xiàn),為揭示CTCs的分子生物學(xué)特征及其在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中的作用提供了可能。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[14]。在這個(gè)過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞失去極性、黏附性等上皮表型,轉(zhuǎn)化為具有較高運(yùn)動(dòng)、侵襲能力的間質(zhì)表型,從而大大提升了腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力[15]?，F(xiàn)有研究表明,上皮細(xì)胞源性腫瘤細(xì)胞在SNAI1、ZEB、MMP9、TWIST等家族轉(zhuǎn)錄因子作用下,E-鈣黏蛋白表達(dá)受到抑制,發(fā)生EMT,失去極性與細(xì)胞黏附性,從原位腫瘤組織脫落并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)[16]。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的CTCs大部分發(fā)生凋亡,或在免疫編輯作用下進(jìn)入休眠狀態(tài),24 h后僅約0.1%的CTCs仍存活,其中不足1/10具有致瘤性[17]。EMT是一個(gè)受多種因子和信號(hào)通路調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程,它的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究加以闡明。IL-6長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為有促進(jìn)結(jié)直腸惡性腫瘤EMT的功能。Liu等[18]證實(shí)了fos相關(guān)抗原-1 (Fra-1)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3 (singnal transducer and activator of transciption 3,STAT3)共同調(diào)控IL-6誘導(dǎo)EMT過(guò)程。在用RNA干預(yù)STAT3或IL-6的表達(dá)后,EMT、細(xì)胞遷移、組織侵犯等現(xiàn)象都受到阻礙。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控廣泛的生物過(guò)程,包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞擴(kuò)增、細(xì)胞凋亡等。Maier等[19]發(fā)現(xiàn)NF-κB受抑制時(shí),轉(zhuǎn)變生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)的EMT無(wú)法發(fā)生,而活化NF-κB后,細(xì)胞呈現(xiàn)出波形蛋白和ZEB1的上調(diào)控及E-鈣黏蛋白的下調(diào)控等EMT特征。Gu等[20]發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中IL-17經(jīng)NF-κB介導(dǎo)上調(diào)控ZEB1,誘發(fā)EMT?；趯?duì)EMT的調(diào)節(jié)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析,Chanrion等[21]提出并驗(yàn)證了p53的丟失和Notch激活協(xié)同誘導(dǎo)EMT。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶能激活P13K/Akt和NF-κB通路,進(jìn)一步激活SNAI1和MMP-9誘導(dǎo)EMT。Salnikov等[23]證明低氧環(huán)境會(huì)正調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因,使得E-鈣黏蛋白表達(dá)量降低,波形蛋白表達(dá)量升高。Zheng等[24]利用敲除了Snai1或Twist的基因工程鼠,證明了EMT的抑制并不改變胰管腺癌的發(fā)生、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,但導(dǎo)致均衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和集中核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá),進(jìn)而提高了對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性和整體存活率。

CTCs的保護(hù)機(jī)制 進(jìn)入血液系統(tǒng),CTCs將受到血液剪應(yīng)力、免疫細(xì)胞殺傷等滅活作用。在傳播過(guò)程中CTCs采取多種機(jī)制自我保護(hù),包括利用血小板為保護(hù)屏障、回避免疫識(shí)別等方式。腫瘤細(xì)胞在血液中與血小板聚合,可抵御血液流動(dòng)的剪應(yīng)力。Zheng等[25]發(fā)現(xiàn)血小板和腫瘤細(xì)胞均表達(dá)纖維蛋白原的主要受體——β整合蛋白,纖維蛋白原能將兩者橋連,加強(qiáng)兩者的結(jié)合,促進(jìn)對(duì)CTCs的保護(hù)。肝素及其化學(xué)衍生物可以抑制纖維蛋白原與β整合蛋白的結(jié)合,具有發(fā)展為抗癌癥轉(zhuǎn)移藥物的潛力。免疫識(shí)別方面,CD47是一種廣泛表達(dá)的跨膜蛋白,可與巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等表達(dá)的單調(diào)控蛋白α結(jié)合抑制其吞噬作用,Willingham等[26]系統(tǒng)地分析了人體各部位(包括卵巢、乳腺、結(jié)腸、膀胱、前列腺等)惡性腫瘤細(xì)胞的CD47表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的CD47表達(dá)量平均約為相應(yīng)正常細(xì)胞的3.3倍。同一研究發(fā)現(xiàn)CD47 mRNA水平與患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)負(fù)相關(guān),而抗CD47抗體使吞噬作用恢復(fù),進(jìn)一步證明了CD47的高表達(dá)能夠降低免疫系統(tǒng)對(duì)CTCs的殺傷。單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)是一種能夠吸引自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)、記憶T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的趨化因子,與腫瘤的生長(zhǎng)與擴(kuò)散相關(guān)。Mardani等[27]分析比較了健康志愿者、良性/惡性唾液腺腫瘤患者血清樣品中的MCP-1濃度,發(fā)現(xiàn)高進(jìn)展患者的血樣中MCP-1濃度較低,認(rèn)為低濃度MCP-1為腫瘤的擴(kuò)散提供了有利條件。NK細(xì)胞是一類通過(guò)穿孔蛋白和顆粒酶直接殺死腫瘤細(xì)胞,或通過(guò)調(diào)控干擾素γ (interferon γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等因子間接消滅腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞,是人體免疫系統(tǒng)中重要的抗癌細(xì)胞,其激活依賴于多種蛋白質(zhì)受體。Rocca等[28]發(fā)現(xiàn)外周血中NK細(xì)胞表面的CD16、NKG2D、DNAM-1、CD161、NKp46、NKp30等激活受體表達(dá)受到負(fù)調(diào)節(jié),而CD85j、NKG2A等抑制受體受到正調(diào)節(jié),使得NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用與IFN-γ分泌量均下降,推測(cè)在癌癥擴(kuò)散過(guò)程中,NK細(xì)胞活性降低導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞的存活能力增強(qiáng)。蛋白酶激活受體-1 (protease activated receptors-1,PAR-1)在乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤細(xì)胞等表面的過(guò)表達(dá)也與其轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。Villares等[29]發(fā)現(xiàn)PAR-1負(fù)調(diào)控乳腺絲抑蛋白質(zhì)的水平,而后者能增加腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、減少腫瘤血管生成。在充分了解CTCs躲避免疫系統(tǒng)攻擊的分子水平機(jī)制后,有可能利用人體自身免疫干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展。

異質(zhì)性 腫瘤組織具有異質(zhì)性(如突變位點(diǎn)、細(xì)胞表型不同),CTCs不僅具有同樣的異質(zhì)性,還可能成為研究腫瘤異質(zhì)性的有效工具。Li等[30]以角蛋白8、18、19及EpCAM為上皮細(xì)胞(E)標(biāo)志物,以波形蛋白和TWIST為間質(zhì)細(xì)胞(M)標(biāo)志物,對(duì)胃癌患者CTCs進(jìn)行染色,將CTCs分為5類(E,E>M,E=M,E14.99 μm)、小核(8.54～14.99 μm)、極小核(<8.54 μm),小核與極小核CTCs的數(shù)量與癌癥轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),極小核CTCs的數(shù)量與內(nèi)臟轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。CTCs由于EMT、環(huán)境誘導(dǎo)等因素,可能獲得區(qū)別于原位腫瘤的突變,使其具有區(qū)別于原位腫瘤的性質(zhì)及更豐富的異質(zhì)性。CD24是一種在乳腺上皮細(xì)胞表面普遍存在的標(biāo)記物。Rostoker等[32]從乳腺癌細(xì)胞株Mvt1中分離出CD24+和CD24-兩種細(xì)胞,證明CD24+細(xì)胞更易于聚集成微球體,CD24+腫瘤生長(zhǎng)更快,也更容易轉(zhuǎn)移。他們還發(fā)現(xiàn),自CD24+細(xì)胞增殖而成的腫瘤中約70%的細(xì)胞呈CD24-。Pavese等[33]利用由前列腺癌原位移植小鼠產(chǎn)生的CTCs細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞侵襲、遷移、群落形成、異種移植等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與原位腫瘤細(xì)胞相比,CTCs的倍增時(shí)間、細(xì)胞形態(tài)、遷移能力、誘導(dǎo)形成的腫瘤大小無(wú)明顯變化,而侵襲能力增加了50%,發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞增多。進(jìn)一步研究表明CTCs的MMP-2以及EMT相關(guān)蛋白質(zhì)量增多,且呈現(xiàn)出與原位腫瘤細(xì)胞稍有差異的藥敏性(對(duì)米妥蒽醌類藥物抗性升高)。Pailler等[34]檢測(cè)4位c-ros原癌基因1 (ROS1)重排的非小細(xì)胞肺癌患者CTCs,發(fā)現(xiàn)其ROS1拷貝數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差顯著高于腫瘤組織細(xì)胞,顯示其具有更高的異質(zhì)性。一方面,CTCs通常呈現(xiàn)出較臨床獲取的局部腫瘤組織更豐富的異質(zhì)性,在基于患者個(gè)體化基因型和表現(xiàn)型制定用藥方案時(shí)能提供有力的支持與指導(dǎo);另一方面,CTCs可能較腫瘤組織細(xì)胞,累積了額外的基因突變,在通過(guò)其分子生物學(xué)特性作為觀察腫瘤組織的窗口時(shí),需持科學(xué)謹(jǐn)慎態(tài)度。

干細(xì)胞特征 研究表明,CTCs中只有少部分細(xì)胞能夠形成腫瘤,這些細(xì)胞被認(rèn)為具有干性,或稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)。CD133被視為胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物,Nomura等[35]研究CD133過(guò)表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)諸多被認(rèn)為與干性相聯(lián)系的基因(如KITLG、LIN28B、MYC、SOX2等基因)以及與EMT相關(guān)的基因,(如SNAI1、ZEB1、MMP9等)均上調(diào);CD133過(guò)表達(dá)的細(xì)胞用于異種移植時(shí),成瘤率和腫瘤生長(zhǎng)速率均顯著提升。Grillet等[36]將轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者CTCs建株,檢測(cè)到其ALDH1A1、CD133、EpCAM、CD26、CD44v6等蛋白質(zhì)高含量,結(jié)合極限稀釋分析結(jié)果,認(rèn)為所得細(xì)胞株中CSC的比例低于5%。Salnikov等[24]在多種惡性腫瘤(如胰管腺癌、乳腺癌、肺癌等)中,發(fā)現(xiàn)低氧標(biāo)志物HIF-2α陽(yáng)性區(qū)域也是CD133陽(yáng)性區(qū)域。他們還證明低氧環(huán)境能提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力,而將腫瘤細(xì)胞按分化程度、p53突變、群落形成能力等參數(shù)劃分為CSC高表達(dá)亞群和CSC低表達(dá)亞群后,發(fā)現(xiàn)CSC高表達(dá)亞群的基礎(chǔ)遷移能力與低氧誘導(dǎo)的遷移能力均高于CSC低表達(dá)亞群,由此認(rèn)為CSC是組織侵入和癌癥轉(zhuǎn)移的根源。CSC具有特殊的增殖能力和抗藥性,在癌癥擴(kuò)散和復(fù)發(fā)中都起到關(guān)鍵作用。以CTCs為載體系統(tǒng)地研究CSC是腫瘤生物學(xué)今后發(fā)展的重中之重。

CTCs的培養(yǎng)擴(kuò)增臨床血樣中可采集到的CTCs數(shù)量極少,除能進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與基因測(cè)序外,通常不足以用于常規(guī)的藥敏性測(cè)試或細(xì)胞表型分析,故CTCs的穩(wěn)定培養(yǎng)擴(kuò)增是CTCs下游功能的分析的基礎(chǔ)。同時(shí),在細(xì)胞數(shù)量很少的情況下,細(xì)胞間的旁分泌信號(hào)匱乏,會(huì)增加細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的困難。 Yu等[37]通過(guò)CTC-ichip采集雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的CTCs,用加入了表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、基本纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、B27添加劑的RPMI-1640培養(yǎng)基,在超低黏附多孔板中及低氧(4%O2)條件下,成功將17.14% (6/35)的樣品CTCs增殖,倍增時(shí)間為3天至3周,同時(shí)還報(bào)道了貼壁會(huì)誘使CTCs衰老這一現(xiàn)象。Cayrefourcq等[38]用CellSearch系統(tǒng)采集轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸惡性腺癌患者的CTCs懸浮培養(yǎng),先置于加入了胰島素、左旋谷氨酸鹽、EGF、FGF-2、N2添加劑、少量胚胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,低氧(2%O2)條件下培養(yǎng),后轉(zhuǎn)移到加入了EGF、FGF-2、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑的RPMI-1640培養(yǎng)基中,常氧條件下培養(yǎng),得到能夠長(zhǎng)期存活的細(xì)胞株。Gao等[39]用Ficoll?Paque系統(tǒng)離心得到轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的CTCs,分散在Matrigel中為類器官,浸泡于加入了多種添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基中,將5.88% (1/17)的樣品成功擴(kuò)增,倍增時(shí)間為1周,突變情況和結(jié)構(gòu)分別與原位腫瘤細(xì)胞和組織相似。Zhang等[40]用CTC-chip固定早期肺癌患者外周血中的CTCs,先在芯片上加入纖維組織母細(xì)胞和膠原、Matrigel,浸泡在添加了胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中3D-共培養(yǎng)1周,腫瘤細(xì)胞數(shù)量平均提高到8倍;后將細(xì)胞從芯片上釋放轉(zhuǎn)移到多孔板中繼續(xù)培養(yǎng)1周,腫瘤細(xì)胞數(shù)量平均提高到54倍,總培養(yǎng)成功率為73.68% (14/19)。CTCs培養(yǎng)成功率普遍較低是目前面臨的學(xué)術(shù)難題。目前尚無(wú)適用于所有不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但每一類腫瘤CTCs的成功培養(yǎng),都將極大地推進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的研究和相關(guān)臨床治療。

CTCs在胰腺癌診療中的應(yīng)用中國(guó)腫瘤登記中心最新發(fā)布結(jié)果顯示,2000年至2011年間我國(guó)胰腺癌發(fā)病率與死亡率逐年攀升,預(yù)計(jì)2015年全國(guó)新發(fā)胰腺癌約9萬(wàn)例,死亡約8萬(wàn)例[41]。早期診斷困難與缺乏有效的個(gè)體化治療方案是導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后極差的重要原因。80%左右的患者確診時(shí)已發(fā)生腫瘤外周侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療[42]。CA19-9是臨床最重要的胰腺癌血清生物學(xué)標(biāo)記,但敏感性和特異性僅為80%和82%,部分胰腺癌患者CA19-9水平不升高,部分良性疾病(如胰腺炎、膽道梗阻)患者會(huì)出現(xiàn)CA19-9水平升高的假陽(yáng)性[43]。因此,需要尋找新的有效的生物標(biāo)志物,不僅可以用于胰腺癌的早期診斷,而且可以監(jiān)測(cè)療效,指導(dǎo)臨床治療。CTCs作為液體活檢的重要組成部分,是目前臨床研究的熱點(diǎn)。胰腺的靜脈血首先經(jīng)門靜脈系統(tǒng)回流至肝臟,然后再到達(dá)體循環(huán),外周血CTCs明顯少于乳腺癌、前列腺癌等腫瘤。胰腺癌基質(zhì)豐富,腫瘤細(xì)胞所占比例較少,因此外周血中的CTCs也少于同樣經(jīng)門靜脈回流的結(jié)直腸癌、胃癌[44]。部分研究因胰腺癌CTCs檢出率低、單位血樣中CTCs計(jì)數(shù)少,而未能得出有意義的結(jié)論[45]。

診斷和分期 Kulemann等[46]用Screencell系統(tǒng)檢測(cè)的一組胰腺癌病例中,75.0%的早期患者(AJCC分期≤ⅡB期)CTCs陽(yáng)性,71.4%的晚期患者(AJCC分期≥Ⅲ期)CTCs陽(yáng)性。因此CTCs并不只出現(xiàn)于轉(zhuǎn)移或晚期患者,胰腺癌的不同分期都可以出現(xiàn)CTCs。Zhang等[47]采用CK、CD45、DAPI和CEP8(染色體著絲粒探針8)作為標(biāo)志物檢測(cè)了22例胰腺癌、3例胰腺實(shí)性假乳頭狀瘤、6例胰腺良性腫瘤患者和30例健康志愿者。將CK(+)、CD45(+)、DAPI(+)和CEP≥2作為胰腺癌CTCs標(biāo)準(zhǔn)時(shí),CTCs計(jì)數(shù)≥2個(gè)/3.75 mL診斷胰腺癌的敏感性和特異性分別達(dá)到68.18%和94.87%。Zhou等[48]檢測(cè)C-MET、h-TERT、CK20和CEA基因在胰腺癌CTCs中的表達(dá)分別為80%、100%、84%和80%,而在正常體細(xì)胞中為0、0、6.7%和0。如將上述4個(gè)基因表達(dá)同時(shí)作為胰腺癌CTCs標(biāo)準(zhǔn)時(shí),診斷的敏感性和特異性均可以達(dá)到100%。Ankeny等[49]檢測(cè)72例胰腺癌患者和28例其他胰腺疾病患者的CTCs,顯示Ⅰ～Ⅱ期患者CTCs陽(yáng)性率為54.84% (17/31)、Ⅲ期陽(yáng)性率為78.57% (11/14)、Ⅳ期陽(yáng)性率為96.30% (26/27);28例其他胰腺疾病患者中僅1例檢測(cè)出了1個(gè)CTCs;統(tǒng)計(jì)表明可以將CTCs≥3個(gè)/4 mL作為Ⅳ期胰腺癌的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。CTCs有望成為胰腺癌診斷和分期的生物學(xué)標(biāo)志。

療效和預(yù)后 Sheng等[50]觀察了3例接受化療的Ⅳ期胰腺癌患者,采用CT進(jìn)行療效隨訪的同時(shí),檢測(cè)患者的CTCs。當(dāng)CT顯示治療有效、病灶縮小時(shí),CTCs計(jì)數(shù)同時(shí)下降。因此CTCs計(jì)數(shù)有可能成為比CT損傷更小的療效觀察指標(biāo)。Khoja等[51]分別用CellSearch系統(tǒng)(根據(jù)上皮表型-EpCAM/CK富集CTCs)和ISET系統(tǒng)(根據(jù)細(xì)胞大小富集CTCs)獲取54例胰腺癌患者的CTCs,ISET系統(tǒng)的CTCs檢出率為93%,明顯高于CellSearch系統(tǒng)的40%,ISET系統(tǒng)檢測(cè)的CTCs中位值為9個(gè)/7.5 mL,亦明顯高于CellSearch系統(tǒng)的0個(gè)/7.5 mL。這一研究結(jié)果表明,CTCs中僅一小部分具有上皮表型,EMT過(guò)程使部分CTCs喪失了上皮表型,同時(shí)獲得間質(zhì)表型。只有對(duì)所有表型的CTCs進(jìn)行分析,才能更好地研究腫瘤的異質(zhì)性。采用CTCs評(píng)價(jià)患者預(yù)后時(shí),應(yīng)考慮CTCs的EMT現(xiàn)象,也就是不能僅分析上皮表型的CTCs,還應(yīng)考慮間質(zhì)表型的CTCs。Poruk等[52]分析了50例胰腺癌患者(其中44例接受外科手術(shù))的CTCs,分別觀察具有上皮表型(角蛋白陽(yáng)性)和間質(zhì)表型(波形蛋白陽(yáng)性)的CTCs對(duì)患者預(yù)后的影響。他們發(fā)現(xiàn),上皮表型CTCs陽(yáng)性預(yù)示患者生存期較短,間質(zhì)表型CTCs與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān),檢測(cè)到間質(zhì)表型CTCs的患者中位復(fù)發(fā)時(shí)間為9.5個(gè)月,而間質(zhì)表型CTCs陰性的患者則為13.5個(gè)月。

胰腺癌CTCs的分子生物學(xué) 雖然,目前有關(guān)胰腺癌CTCs分子生物特征的研究很少,但是這些報(bào)道仍顯示出樂(lè)觀的研究前景。黏蛋白-1(Mucin-1)是一種和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的跨膜糖蛋白,它的表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后較差。目前,已有針對(duì)黏蛋白-1的IgG抗體應(yīng)用于臨床,但是有時(shí)病灶穿刺活檢的樣本量太少,無(wú)法進(jìn)行黏蛋白-1的測(cè)定。Dotan等[53]對(duì)23例CTCs陽(yáng)性的患者進(jìn)行了黏蛋白-1表達(dá)的觀察,發(fā)現(xiàn)10例(43%)黏蛋白-1陽(yáng)性,黏蛋白-1陽(yáng)性患者的中位生存期2.7個(gè)月,明顯低于黏蛋白-1陰性患者的9.6個(gè)月(P=0.044)。因此,通過(guò)對(duì)CTCs的黏蛋白-1表達(dá)分析,可以指導(dǎo)臨床用藥。Court等[54]采用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)獲取的胰腺癌CTCs進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,在12例患者獲取的119個(gè)CTCs中有33個(gè)檢測(cè)到了KRAS突變,KRAS突變檢出率達(dá)到了27.7%。并認(rèn)為當(dāng)CTCs數(shù)量達(dá)到10個(gè)以上時(shí),可以用這一單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)得到KRAS突變陽(yáng)性結(jié)果。Sergeant 等[55]對(duì)CTCs的基因表達(dá)進(jìn)行了深入研究,他們從6例接受手術(shù)切除的胰腺癌患者獲得CTCs行RNA擴(kuò)增后,進(jìn)行全基因組測(cè)序,并和原發(fā)腫瘤、血細(xì)胞和胰腺組織對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs有1 059個(gè)基因異常表達(dá),與腫瘤細(xì)胞遷移有關(guān)的細(xì)胞分裂激活激酶p38(p38MAPK)信號(hào)通路上調(diào)。而且和腫瘤細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因高表達(dá)的數(shù)量,直接和患者的無(wú)病生存期和總生存期有關(guān)。

結(jié)語(yǔ)CTCs是探究癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移機(jī)制的理想對(duì)象,近年來(lái)受到臨床熱切關(guān)注;CTCs的特征與癌癥預(yù)后緊密聯(lián)系,有極大的臨床意義。隨著研究方法的不斷進(jìn)步,對(duì)CTCs的認(rèn)識(shí)也從簡(jiǎn)單的數(shù)量鑒定步入對(duì)分子層面的研究。其中,CTCs所表現(xiàn)出的干細(xì)胞特征、異質(zhì)性、免疫逃避機(jī)制等特征及其相關(guān)的后續(xù)臨床應(yīng)用,對(duì)胰腺癌的早期篩查、精準(zhǔn)治療和預(yù)后判斷都有顯著價(jià)值。CTCs在臨床上的推廣運(yùn)用仍需要對(duì)分離獲取方法的標(biāo)準(zhǔn)性、功能性分析的可靠性和前瞻研究的有效性進(jìn)行更加深入和細(xì)致的探究,相信該領(lǐng)域?qū)?huì)是腫瘤學(xué)研究的重點(diǎn)之一。

[1] NAGRATH S,SEQUIST LV,MAHESWARAN S,etal.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology [J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.

[2] ACETO N,BARDIA A,MIYAMOTO DT,etal.Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis [J].Cell,2014,158(5):1110-1122.

[3] HAROUAKA R,KANG Z,ZHENG SY,etal.Circulating tumor cells:advances in isolation and analysis,and challenges for clinical applications [J].PharmacolTher,2014,141(2):209-221.

[4] WONG SC,CHAN CM,MA BB,etal.Clinical significance of cytokeratin 20-positive circulating tumor cells detected by a refined immunomagnetic enrichment assay in colorectal cancer patients[J].ClinCancerRes,2009,15(3):1005-1012.

[5] PACHMANN K,CAMARA O,KAVALLARIS A,etal.Monitoring the response of circulating epithelial tumor cells to adjuvant chemotherapy in breast cancer allows detection of patients at risk of early relapse [J].JClinOncol,2008,26(8):1208-1215.

[6] MORGAN TM,LANGE PH,PORTER MP,etal.Disseminated tumor cells in prostate cancer patients after radical prostatectomy and without evidence of disease predicts biochemical recurrence [J].ClinCancerRes,2009,15(2):677-683.

[7] KARABACAK NM,SPUHLER PS,FACHIN F,etal.Microfluidic,marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples [J].NatProtoc,2014,9(3):694-710.

[8] K?NIGSBERG R,OBERMAYR E,BISES G,etal.Detection Of EPCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients[J].ActaOncol,2011,50(5):700-710.

[9] CEGAN M,KOLOSTOVA K,MATKOWSKI R,etal.Invitroculturing of viable circulating tumor cells of urinary bladder cancer [J]IntJClinExpPathol,2014,7(10):7164-7171.

[10] HOU HW,WARKIANI ME,KHOO BL,etal.Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces [J].SciRep,2013,3:1259.

[11] YEO T,TAN SJ,LIM CL,etal.Microfluidic enrichment for the single cell analysis of circulating tumor cells [J].SciRep,2016,6:22076.

[12] HALO TL,MCMAHON KM,ANGELONI NL,etal.Nanoflares for the detection,isolation,and culture of live tumor cells from human blood [J].ProcNatlAcadSciUSA,2014,111(48):17104-17109.

[13] KAIFI JT,KUNKEL M,DAS A,etal.Circulating tumor cell isolation during resection of colorectal cancer lung and liver metastases:a prospective trial with different detection techniques [J].CancerBiolTher,2015,16(5):699-708.

[15] LAMOUILLE S,XU J,DERYNCK R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].NatRevMolCellBiol,2014,15(3):178-196.

[16] NIETO MA.The ins and outs of the epithelial to mesenchymal transition in health and disease [J].AnnuRevCellDevBiol,2011,27:347-376.

[17] UHR JW,PANTEL K.Controversies in clinical cancer dormancy [J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(30):12396-12400.

[18] LIU H,REN G,WANG T,etal.Aberrantly expressed FRA-1 by IL-6/STAT3 transactivation promotes colorectal cancer aggressiveness through epithelial-mesenchymal transition [J].Carcinogenesis,2015,36(4):459-468.

[19] MAIER HJ,SCHMIDT-STRASSBURGER U,HUBER MA,etal.NF-kappa B promotes epithelial-mesenchymal transition,migration and invasion of pancreatic carcinoma cells [J].CancerLett,2010,295(2):214-228.

[20] GU K,LI MM,SHEN J,etal.Interleukin-17-induced emt promotes lung cancer cell migration and invasion via NF-κB/ZEB1 signal pathway [J].AmJCancerRes,2015,5(3):1169-1179.

[21] CHANRION M,KUPERSTEIN I,BARRIRE C,etal.Concomitant notch activation and p53 deletion trigger epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis in mouse gut [J].NatCommun,2014,5:5005.

[22] YANG X,LIU S,YAN Q.Roleof fucosyltransferase iv in epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells [J].CellDeathDis,2013,4:e735.

[23] SALNIKOV AV,LIU L,PLATEN M,Hypoxia induces emt in low and highly aggressive pancreatic tumor cells but only cells with cancer stem cell characteristics acquire pronounced migratory potential [J].PLoSOne,2012,7(9):e46391.

[24] ZHENG X,CARSTENS JL,KIM J,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer [J].Nature,2015,527(7579):525-530.

[25] ZHENG S,LIU Y,JIAO Y,etal.Chemically modified heparins inhibit fibrinogen-bridged indirect adhesion between tumor cells and platelets [J].OncolLett,2012,3(2):497-502.

[26] WILLINGHAM SB,VOLKMER JP,GENTLES AJ,etal.The CD47-signal regulatory protein alpha (sirpa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors [J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(17):6662-6667.

[27] MARDANI M,TADBIR AA,KHADEMI B,etal.Decreased serum monocyte chemoattractant protein 1 in salivary gland tumor patients [J].AsianPacJCancerPrev,2016,17(7):3601-3604.

[28] ROCCA YS,ROBERTI MP,JULIA EP,etal.Phenotypic and functional dysregulated blood nk cells in colorectal cancer patients can be activated by cetuximab plus IL-2 or IL-15 [J].FrontImmunol,2016,7:413.

[29] VILLARES GJ,ZIGLER M,DOBROFF AS,etal.Protease activated receptor-1 inhibits the maspin tumor-suppressor gene to determine the melanoma metastatic phenotype [J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(2):626-631.

[30] LI TT,LIU H,LI FP,etal.Evaluation of epithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells inpatients with resectable gastric cancer:relevance to therapy response [J].WorldJGastroenterol,2015,21(47):13259-13267.

[31] CHEN JF,HO H,LICHTERMAN J,etal.Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases [J].Cancer,2015,121(18):3240-3251.

[32] ROSTOKER R,ABELSON S,GENKIN I,etal.CD24(+) cells fuel rapid tumor growth and display high metastatic capacity [J].BreastCancerRes,2015,17:78.

[33] PAVESE JM,BERGAN RC.Circulating tumor cells exhibit a biologically aggressive cancer phenotype accompanied by selective resistance tochemotherapy[J].CancerLett,2014,352(2):179-186.

[34] PAILLER E,AUGER N,LINDSAY CR.High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ros1-rearranged non-small-cell lung cancer[J].AnnOncol,2015,26(7):1408-1415.

[35] NOMURA A,BANERJEE S,CHUGH R,etal.CD133 initiates tumors,induces epithelial-mesenchymal transition and increases metastasis in pancreatic cancer [J].Oncotarget,2015,6(10):8313-8322.

[36] GRILLET F,BAYET E,VILLERONCE O,etal.Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks inexvivoculture [J].Gut,2017,66(10):1802-1810.

[37] YU M,BARDIA A,ACETO N,etal.Cancer therapy.Exvivoculture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility [J].Science,2014,345(6193):216-220.

[38] CAYREFOURCQ L,MAZARD T,JOOSSES,etal.Establishment and characterization of a cell line from human circulating colon cancer cells [J].CancerRes,2015,75(5):892-901.

[39] GAO D,VELA I,SBONER A,etal.Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer [J].Cell,2014,159(1):176-187.

[40] ZHANG Z,SHIRATSUCHI H,LIN J,etal.Expansion of CTCs from early stage lung cancer patients using a microfluidic co-culture model [J].Oncotarget,2014,5(23):12383-12397.

[41] CHEN W,ZHENG R,BAADE PD,etal.Cancer statistics in China,2015 [J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.

[43] DUFFY MJ,STURGEON C,LAMERZ R,etal.Tumor markers in pancreatic cancer:a European Group on Tumor Markers (EGTM) Status Report[J].AnnOncol,2010,21(3):441-447.

[44] ALLARD WJ,MATERA J,MILLER MC,etal.Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases [J].ClinCancerRes,2004,10(20):6897-6904.

[45] GALL TM,FRAMPTON AE,KRELL J,etal.Is the detection of circulating tumor cells in locally advanced pancreatic cancer a useful prognostic marker? [J] .ExpertRevMolDiagn,2013,13(8):793-796 .

[46] KULEMANN B,PITMAN MB,LISS AS,etal.Circulating tumor cells found in patients with localized and advanced pancreatic cancer [J].Pancreas,2015,44(4):547-550.

[47] ZHANG Y,WANG F,NING N,etal.Patterns of circulating tumor cells identified by CEP8,CK and CD45 in pancreatic cancer [J].IntJCancer,2015,136(5):1228-1233.

[48] ZHOU JH,HU L,YU ZQ,etal.Marker expression in circulating cancer cells of pancreatic cancer patients [J].JSurgRes,2011,171(2):631-636.

[49] ANKENY JS,COURT CM,HOU S,etal.Circulating tumour cells as a biomarker for diagnosis and staging in pancreatic cancer [J].BrJCancer,2016,14,114(12):1367-1375.

[50] SHENG W,OGUNWOBI OO,CHEN T,etal.Capture,release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip [J].LabChip,2014,14(1):89-98.

[51] KHOJA L,BACKEN A,SLOANE R,etal.A pilot study to explore circulating tumor cells in pancreatic cancer as a novel biomarker [J].BrJCancer,2012,106(3):508-516.

[52] PORUK KE,VALERO V 3RD,SAUNDERS T,etal.Circulating tumor cell phenotype predicts recurrence and survival in pancreatic adenocarcinoma[J].AnnSurg,2016,264(6):1073-1081.

[53] DOTAN E,ALPAUGH K,RUTH K,etal.Prognostic significance of MUC-1 in circulating tumor cells in patients with metastatic pancreatic adenocarcinoma [J].Pancreas,2016,45(8):1131-1135.

[54] COURT CM,ANKENY JS,SHO S,etal.Reality of single circulating tumor cell sequencing for molecular diagnostics in pancreatic cancer [J].JMolDiagn,2016,18(5):688-696.

[55] SERGEANT G,VAN EIJSDEN R,ROSKAMS T,etal.Pancreatic cancer circulating tumour cells express a cell motility gene signature that predicts survival after surgery [J].BMCCancer,2012,12:527.