王曉鋒 ，張　磊 ，袁興中

（1.重慶師范大學(xué)　地理與旅游學(xué)院，重慶　400047；2.長江上游濕地科學(xué)研究中心，重慶　400047；3.西南大學(xué)　資源環(huán)境學(xué)院，重慶　400716；4.重慶大學(xué)　資源及環(huán)境科學(xué)學(xué)院，重慶　400030）

由于人類活動影響，近年來土壤酸化問題不斷加劇[1]。我國受大面積施肥、酸雨和氮沉降等影響，土壤酸化問題嚴重，導(dǎo)致土壤肥力和生產(chǎn)力退化[2]。據(jù)統(tǒng)計我國酸性土壤面積達到203萬平方千米，占我國國土面積21%，且90%以上酸性土壤分布在長江流域及其以南地區(qū)[2]。三峽庫區(qū)位于長江流域中上游，分布著大面積酸性黃壤（僅重慶市pH＜6.5的土壤面積就達到3.86萬平方千米，占重慶市國土面積的46.8%①http：//www.cqates.com/cqsoil/），加之庫區(qū)生態(tài)環(huán)境整體較為脆弱，酸性土壤恢復(fù)與治理對三峽庫區(qū)生態(tài)恢復(fù)意義重大。紫花苜蓿（Medicago sativa L.，俗稱alfalfa）是一種在歐亞大陸和世界各國廣泛種植的優(yōu)良豆科綠肥，其根系發(fā)達，適應(yīng)性強，與根瘤菌共生后具有極強的固氮能力[3]，因此被應(yīng)用于多種退化土壤的培肥和修復(fù)。隨著我國西部開發(fā)戰(zhàn)略和土壤保護發(fā)展需要，紫花苜蓿被列入我國“北草南引”的重大戰(zhàn)略名錄。然而，酸性土壤下紫花苜蓿的生長、結(jié)瘤受到極大限制[4]，成為南方酸性土壤中種植紫花苜蓿修復(fù)土壤的重要阻礙。提高紫花苜蓿在酸性土壤中的適應(yīng)性和結(jié)瘤固氮能力對解決這一限制至關(guān)重要。

研究表明，酸性環(huán)境能夠影響根瘤菌繁殖[5]、宿主根毛伸長[6]、根瘤菌與宿主植物間的信號識別過程[7]以及豆科植物-根瘤菌體系固氮酶活性和固氮能力[8]等，進而不利于豆科作物的生長。為提高酸性土壤中豆科植物-根瘤菌共生體系的固氮能力，研究者進行了大量的探索。接種耐酸根瘤菌被認為是提高豆科植物在酸性條件下生長和固氮的有效途徑[9-11]。在三葉草根瘤菌的研究中，Chen等[11]通過接種耐酸根瘤菌ANU1173使得宿主在pH值為4.4條件下結(jié)瘤并有效固氮。研究表明，接種從酸性土壤中分離到的一些中等耐酸的苜蓿根瘤菌可使紫花苜蓿在pH值為5.6下高效固氮[12]。同時，根瘤菌與宿主的結(jié)瘤共生過程被認為必須有磷素的參與[13-14]，甚至有研究表明磷素能夠直接參與共生過程中的信號物質(zhì)的生成和傳遞[15]。進一步研究表明，施磷與接種根瘤菌能夠有效提高豆科植物-根瘤菌結(jié)瘤共生[15]。紫花苜蓿對酸性極為敏感，因此通常被作為豆科植物-根瘤菌酸性環(huán)境適應(yīng)性研究的模式植物。

近年來，研究者在施磷與接種根瘤菌對紫花苜蓿的影響方面開展了一些研究[16-17]，且認為施磷與接種根瘤菌能夠顯著提高黃河三角洲紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)[17]，并能提高紫花苜蓿結(jié)瘤率、根瘤重等[16]。然而，酸性土壤條件下，施磷與接種耐酸根瘤菌對紫花苜蓿生長、結(jié)瘤以及固氮的影響的研究較少。本研究組保藏了多株高效耐酸紫花苜蓿根瘤菌，能夠在pH值為4.6～5.0條件下繁殖并侵染宿主[18]。本文通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗研究接種耐酸根瘤菌和施磷對紫花苜蓿在酸性土壤中結(jié)瘤固氮的改善效果，以期為酸化土壤的修復(fù)提供科學(xué)參考。

1　材料方法

1.1　試驗材料

供試菌株為苜蓿根瘤菌91522，由西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物研究室提供，通過16 s RNA鑒定為中華苜蓿根瘤菌屬，該菌株能夠在pH值為4.8的YMA固體培養(yǎng)基上生長繁殖，并能與紫花苜蓿在pH值為4.5的條件下高效結(jié)瘤[18]。根瘤菌培養(yǎng)基采用改進的YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉（NaCl）0.1 g，七水硫酸鎂（Mg?SO4· 7H2O）0.2 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.5 g[19]。

供試植物為三得利紫花苜蓿（Medicago sativaL.cv.Sanditi），購自江蘇省連云港草業(yè)中心（發(fā)芽率：85.4%）。紫花苜蓿種子經(jīng)過0.1%的氯化汞溶液和95%乙醇表面消毒10 min，于28℃暗室-光照交替催芽2～3 d備用。

供試土壤采自重慶市北碚區(qū)縉云山農(nóng)田區(qū)的酸性冷沙黃泥土，pH＜4.8，種植前茬作物為馬鈴薯與玉米。供試土壤基本理化性質(zhì)如表1所示：

表1　供試土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1　Chemical properties of the experimental soil

1.2　試驗設(shè)計及分析方法

試驗設(shè)置接種耐酸根瘤菌和施磷2個因子。接種處理分為（1）不接種；（2）接種耐酸根瘤菌（1 kg土壤接種OD600=1.0的菌液1 mL）。施磷處理以不同濃度磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液為磷源，分為（1）不施磷；（2）施加4μmol/kg；（3）施加30μmol/kg。共形成6個處理組，各處理組縮寫見表2，每個處理3個重復(fù)。試驗于2012年4月至6月在西南大學(xué)溫室內(nèi)進行。

表2　接種與施磷試驗處理Table 2　Rhizobium and phosphate fertilizer treatments

試驗用塑料盆每盆盛土2 kg，均勻散播經(jīng)催芽的紫花苜蓿種子40粒，表面覆少量濕土，將培養(yǎng)好的OD600=1.0的菌液2 mL用無菌水稀釋后均勻澆灌于每盆中，用牛皮紙蓋上，保持濕度，待發(fā)芽后打開牛皮紙，開始光照/黑暗=16 h/8 h的培養(yǎng)。苜蓿幼苗長出2～3片子葉時（2周），進行施磷處理。施磷處理的方法為，每天用濃度為0μmol/L，4μmol/L，30μmol/L的Na2HPO4溶液進行澆灌一次，每次200 mL，累計處理2 000 mL后停止（10 d），之后用自來水進行日常灌溉管理，保持土壤含水量為田間持水量的40%～50%。從散入苜蓿種子起，培養(yǎng)100 d后收獲，宿主植物地上部與地下部分開收獲，測定生物量、全氮含量和其他農(nóng)藝性狀。

隨機取15～20株苜蓿根清洗干凈，將結(jié)瘤的根系分別剪開，統(tǒng)計肉眼可見的結(jié)瘤數(shù)、根瘤重。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定植物根系活力[20]；主根上的瘤子可用剝皮法取下，側(cè)根瘤要帶少量根剪斷，總計取飽滿根瘤2 g于150 mL血清瓶中，蓋上膠塞，立即向血清瓶中注入15 mL乙炔（C2H2），28℃培養(yǎng)1 h后利用氣相色譜測定瓶中乙烯（C2H4）產(chǎn)生量，并用根瘤還原C2H2為乙烯的量表征固氮酶活性[21]。植株全氮含量采用半微量凱氏定氮法測定；在收獲植物后，取植物根周土壤，利用稀釋平板計數(shù)法測定各處理土壤中根瘤菌數(shù)量。

1.3　數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)在Excel中進行標準化處理，應(yīng)用SPSS18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，在0.05水平下進行LSD多重比較檢驗。

公司采購處理速度快的計算機設(shè)備（每臺設(shè)備8千元），機器設(shè)備估計使用壽命6年，辦公設(shè)備及裝潢使用壽命為5年，期末無殘值，按直線折舊法計算。

2　結(jié)果分析

2.1　施磷與接種耐酸根瘤菌對紫花苜蓿生長的影響

表3所示，接種耐酸根瘤菌能夠提高酸性土壤中紫花苜蓿鮮重，且地下部鮮重顯著提高（P＜0.05）。與對照組（CK0）相比，施磷能夠顯著增加紫花苜蓿生物量，但低磷（NR-P4）與高磷（NR-P30）處理相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。接種耐酸根瘤菌時，高磷處理下（R-P30）紫花苜蓿生物量顯著高于低磷處理（R-P4），可見接種耐酸根瘤菌能夠有效促進紫花苜蓿對磷的利用。接種耐酸根瘤菌同時施用高磷（R-P30）的條件下紫花苜蓿在酸性土壤中生物量最高。

紫花苜蓿在酸性土壤中長勢主要受到磷肥施用的影響（表3）。僅接種根瘤菌對紫花苜蓿株高和根長的影響均不顯著。而僅施磷肥能夠顯著提高苜蓿的株高和根長，尤其在高磷條件下，苜蓿株高和根長比對照組分別增加了117%和58%。施磷與接種根瘤菌對紫花苜蓿株高、根長的交互作用不顯著，但高磷和接種根瘤菌處理下株高、根長均最大。

紫花苜蓿全氮含量與其氮吸收能力和根瘤固氮密切相關(guān)。本研究中，接種耐酸根瘤菌（CK1）后苜蓿地上和地下部全氮含量分別提高了42%和70%，提升效果顯著，與不接種耐酸根瘤菌（CK0）相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。磷素的補充對植物全氮含量也具有一定的增加效果，但并不顯著，可能是施磷促進了植物根系生長，進而增加了對氮素的吸收。高磷與低磷處理植物氮含量間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在同時進行高磷和接種耐酸根瘤菌處理下（R-P30），植物全氮含量最高，與CK0相比，苜蓿地上與地下部氮含量分別提高了71%和105%，總固氮量提高了3.8倍。由此可見，在酸性土壤中，高磷與接種耐酸根瘤菌處理對紫花苜蓿生長、固氮具有極顯著的改善效果，可作為酸性土壤改良的重要手段。

表3　施磷與接種耐酸根瘤菌對酸性土壤中紫花苜蓿生長的影響Table 3　Effects on growth of alfalfa in acid soil by phosphorus fertilization and acid-tolerant rhizobium inoculation

2.2　施磷與接種耐酸根瘤菌對紫花苜蓿根系活力及根周土壤根瘤菌數(shù)量的影響

根系活力是在逆行環(huán)境中植物根系吸收營養(yǎng)以及與根周微生物相互作用的重要保障。對豆科植物而言，植物根系活力和根周土壤中根瘤菌數(shù)量屬二者正常結(jié)瘤共生的重要因子。圖1顯示為不同處理下，紫花苜蓿根系活力和根周土壤中根瘤菌數(shù)量的比較。

圖1　紫花苜蓿根系活力與根周土壤根瘤菌數(shù)量Fig.1　The root vigor of alfalfa and the rhizobia number in the root soil under different treatments

圖1（a）顯示，低磷對酸性土壤苜蓿根系活力的影響不顯著，但高磷條件下，苜蓿根系活力較CK0提高了77%。在相同施磷條件下接種耐酸根瘤菌處理下，紫花苜蓿根系活力均高于不接種處理，比相應(yīng)單施磷處理高出50%～80%；高磷處理下接種耐酸根瘤菌能夠顯著提高苜蓿根系活力，顯著高于其他處理。

根周土壤中根瘤菌數(shù)量是苜蓿結(jié)瘤的前提[5]。本研究結(jié)果顯示，在自然酸性黃壤中，存在少量土著根瘤菌，且隨施磷量增加，土著根瘤菌數(shù)量隨之增加，但總體顯著低于接種處理[圖1（b）]。接種耐酸根瘤菌后，根周土壤根瘤菌數(shù)量比未接種處理提高了10倍多，能夠顯著改善酸性土壤中根瘤菌數(shù)量的不足；接種耐酸根瘤菌同時施加高磷（R-P30），耐酸根瘤菌數(shù)量顯著高于單接種處理（CK1）和接種-低磷處理（R-P4），可見高磷處理能夠有效提高試驗根瘤菌在酸性土壤中的存活率和繁殖速度，進而有利于苜蓿結(jié)瘤。

2.3　施磷與接種耐酸根瘤菌對酸性土壤中紫花苜蓿結(jié)瘤的影響

單株根瘤重量在各處理下變化規(guī)律[圖2（b）]與根瘤數(shù)量相似，均表現(xiàn)為單施磷對根瘤重影響不顯著，接種耐酸根瘤菌處理能夠顯著提高苜蓿根瘤鮮重，較CK0提高了128%；接種耐酸根瘤菌的同時施用磷肥可進一步提高苜蓿根瘤重量，接種和高磷處理下苜蓿根瘤鮮重最大，比CK0提高了4倍。接種耐酸根瘤菌和施磷對于酸性土壤中苜蓿有效結(jié)瘤具有顯著的促進作用。

圖2　紫花苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)量與單株根瘤重Fig.2　The number and the weight of nodules per individual alfalfa

2.4　施磷與接種耐酸根瘤菌對酸性土壤中紫花苜蓿根瘤固氮酶活性的影響

本研究對不同處理下根瘤固氮酶活性進行分析。結(jié)果表明，接種耐酸根瘤菌處理下紫花苜蓿根瘤固氮酶活性顯著高于自然土壤，固氮酶活性提高了2～3倍。施磷對自然土壤中根瘤固氮酶活性有一定影響，高磷處理下固氮酶活性顯著高于低磷和不施磷處理。在接種耐酸根瘤菌的條件下，施磷處理能夠進一步提高耐酸根瘤菌結(jié)瘤的固氮酶活性，高磷處理下固氮酶活性最高?？梢?，施磷和接種耐酸根瘤菌能夠有效提高酸性土壤中苜蓿根瘤固氮能力。

圖3　不同處理下紫花苜蓿根瘤固氮酶活性變化Fig.3　Changes of the nitrogenase activity of the alfalfa nod?ules under different treatments

3　討論

本研究在盆栽條件下模擬酸性土壤中，接種耐酸根瘤菌和施磷對紫花苜蓿生長、結(jié)瘤及固氮的影響。本研究中，施磷能夠顯著提高酸性土壤中紫花苜蓿生物量、株高以及根長（表3）。一方面，磷是植物生長的重要營養(yǎng)元素，施磷能夠解除酸性土壤磷營養(yǎng)的限制，進而有利于植物生長；另一方面，磷素能夠有效緩解酸性土壤中氯離子與氫離子對紫花苜蓿根系生長的毒害[19]，進而可能促進苜蓿生長恢復(fù)。豆科植物根系的正常伸長和變形是根瘤菌附著、侵染、結(jié)瘤的前提，因此施磷可能在一定程度上緩解酸性條件下苜蓿的結(jié)瘤固氮的負面影響。然而，酸性土壤中根瘤菌的生長繁殖也是決定豆科植物結(jié)瘤固氮的關(guān)鍵因子，提高酸性土壤中根瘤菌的數(shù)量至關(guān)重要。本研究中，僅接種耐酸根瘤菌對紫花苜蓿生物量的影響并不顯著，這可能因為僅接種根瘤菌雖然提高了土壤中根瘤菌的數(shù)量（圖1），但在酸性環(huán)境下宿主根系生長受到顯著影響，根瘤菌與宿主植物的信號交流受阻，并不能有效結(jié)瘤[7]。研究表明，施磷能夠有效緩解酸性環(huán)境對根瘤菌的生長繁殖的影響[22]，同時參與根瘤菌與宿主間信號交流過程[13]，因此，本研究中，在接種耐酸根瘤菌與施磷的交互處理下，紫花苜蓿地下部與地上部生物量和含氮量均顯著高于對照處理，表現(xiàn)出較好的固氮效果。本研究認為施磷與接種耐酸根瘤菌能夠有效提高紫花苜蓿-根瘤菌系統(tǒng)在酸性土壤中的適應(yīng)性。

植物根系是活躍的養(yǎng)分吸收器官和合成器官，根系的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長、營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。為明確施磷與接種耐酸根瘤菌改善酸性土壤中苜蓿生長固氮的機理，本研究對不同處理下苜蓿根系活力進行分析。結(jié)果表明，單施磷或單接種耐酸根瘤菌均能夠提高植物根系活力，這與徐亮等[23]、郝鳳等[24]的研究結(jié)果相似；同時施磷和接種耐酸根瘤菌使得根系活力提高2倍多[圖1（a）]。根系活力的提高表征根系代謝活動能力升高，其與根周土壤根瘤菌的信號交流可能增強[24]，進而有利于根瘤菌與宿主根系的識別、侵染。此外，F(xiàn)ujihara和Yoneyama[25]認為，根瘤菌在進入宿主根系前，對酸性環(huán)境極為敏感，因此酸性條件下根周土壤中根瘤菌生存能力和活性是其與宿主結(jié)瘤共生的關(guān)鍵。本研究中，接種耐酸根瘤菌能夠顯著提高苜蓿根周土壤中根瘤菌的數(shù)量，為苜蓿結(jié)瘤提供了條件。同時，施磷能夠緩解H+對根瘤菌繁殖的抑制作用[7-8]，而且施用磷素可通過促進苜蓿根系伸長生長，進而刺激根周微生物的活性[22]。分析結(jié)果表明，施磷和接種耐酸苜蓿根瘤菌處理能夠顯著促進紫花苜蓿的結(jié)瘤數(shù)量[圖2 （a）]與單株根瘤重[圖2 （b）]。因此，接種耐酸根瘤菌同時施加一定量磷肥，可通過改善酸性脅迫下宿主根系活力和根瘤菌繁殖存活，達到提高二者在酸性環(huán)境中共生結(jié)瘤的目的。

豆科植物接種根瘤菌能夠有效增加根瘤的固氮能力[8]。本研究在酸性土壤中接種耐酸根瘤菌不僅能夠促進苜蓿與根瘤菌共生結(jié)瘤，而且有效根瘤的固氮酶活性顯著高于不接種處理組。同時，王樹起等[26]對豆科根瘤菌固氮酶活性與磷濃度關(guān)系的研究認為施磷對提高豆科根瘤的固氮酶活性有顯著的促進作用，在Tang等[27]對紫花苜蓿的研究中也得到相似結(jié)論，這均支持了本研究的結(jié)論。本研究認為，施磷能夠提高酸性環(huán)境中根瘤固氮酶活性，進而增強紫花苜蓿-根瘤菌體系固氮能力。接種耐酸根瘤菌和施磷對酸性土壤中紫花苜蓿的固氮能力具有顯著改善作用，可為苜蓿的逆境種植和酸性土壤改良提供科學(xué)參考。

4　結(jié)論

（1）施磷和接種耐酸根瘤菌能夠顯著促進紫花苜蓿在酸性土壤中的生長，同時提高苜蓿地上和地下部的氮含量和總固氮量，進而提高了酸性土壤中紫花苜蓿的適應(yīng)性。

（2）單施磷肥或僅接種耐酸根瘤菌均能夠提高酸性條件下紫花苜蓿根系活力和根周根瘤菌數(shù)量，且接種耐酸根瘤菌效果優(yōu)于單施磷肥；耐酸根瘤菌接種配以高磷處理可顯著提高宿主根系活力和根周土壤中根瘤菌的繁殖存活，進而有利于酸性條件下紫花苜蓿-根瘤菌的共生結(jié)瘤。

（3）施磷-接種耐酸根瘤菌能夠有效提高酸性土壤中紫花苜蓿根系結(jié)瘤數(shù)量和根瘤鮮重，加之提高紫花苜蓿-根瘤菌共生體的固氮酶活性，進而利于酸性土壤結(jié)瘤固氮。本研究為紫花苜蓿逆境種植和酸性土壤改良提供支撐。

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