陳闊 歐陽英 何天翔 盧煒琪 尹樂斌

摘 要：目的：篩選出邵陽地區(qū)大曲中耐酸、高產(chǎn)淀粉酶微生物并對其相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行研究。方法：采用搖瓶發(fā)酵法與碘顯色法，從湘窖酒曲中初步篩出3株菌落直徑與透明圈直徑比值較大的菌株WB4、WB9、WB13，分別將其在室溫下放置1 h后，采用DNS法測定其酶活。結(jié)果：WB4菌株的酶活力最高，該菌株的最適反應(yīng)溫度為32 ℃，在該條件下獲得淀粉酶活性為2.877 U/mL，其最耐受酒精濃度為10%。結(jié)論：耐酸、高產(chǎn)淀粉酶菌株WB4的篩選對于釀酒行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景，減少了釀酒過程中的酸堿調(diào)節(jié)步驟，在酸性條件下，許多其他雜菌因無法適應(yīng)這一條件而被抑制，為工業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)鍵詞：邵陽大曲;耐酸;高產(chǎn);淀粉酶;篩選;鑒定

Screening and Preliminary Identification of an Acid Tolerant and High Amylase Producing Yeast

CHEN Kuo， OUYANG Ying， HE Tianxiang， LU Weiqi， YIN Lebin*

（Colleage of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective： To screen out the acid-tolerant and high-yielding amylase microorganisms from Daqu in Shaoyang area and study their related biological characteristics. Method： Three strains WB4， WB9 and WB13 with large ratio of colony diameter to transparent circle diameter were screened from Xiangjiao distiller’s yeast by shaking flask fermentation and iodine colorimetry. After being placed at room temperature for 1 h， their enzyme activities were determined by DNS method. Result： The enzyme activity of strain WB4 was the highest， and the optimum reaction temperature of this strain was 32 ℃. The amylase activity obtained under this condition was 2.877 U/mL， and its maximum tolerance to alcohol concentration was 10%. Conclusion： The screening of this acid-resistant and high-yielding amylase strain WB4 has good application prospects for the winemaking industry， reducing the acid-base adjustment steps in the winemaking process. Under acidic conditions， many other miscellaneous bacteria cannot adapt to this condition. Inhibition has brought huge economic benefits to industrial production.

Keywords： Shaoyang Daqu; acid tolerance; high yield; amylase; screening; identification

大曲的主要原料是小麥，形狀類似磚塊，具有豐富的菌系和酶系，是一種釀酒用的糖化劑及發(fā)酵劑，且含有多種能水解和發(fā)酵底物的產(chǎn)酶微生物。釀酒的主要原料由高粱、小麥、玉米等組成，其中含有大量淀粉，淀粉是自然界中的第二大多糖儲備物質(zhì)，是許多食品與非食品行業(yè)的重要組成部分[1]。大曲中能產(chǎn)生淀粉酶的微生物有霉菌、酵母菌、青霉菌和細(xì)菌等，其中淀粉酶已被廣泛運(yùn)用于釀酒、紡織與烘焙等行業(yè)生產(chǎn)，除動(dòng)物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外兩大來源是植物和微生物[2]。

為解決釀酒過程中淀粉漿液化糖化中的調(diào)溫度與調(diào)節(jié)pH等步驟，本文通過考察形態(tài)學(xué)、生理生化特性，利用液體發(fā)酵法對產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從邵陽大曲中篩選出了一株耐酸、高產(chǎn)淀粉酶的酵母菌。而在不同的地域制備的大曲，其微生物多樣性可能存在不同。張雙燕[3]利用MiSeq高通量技術(shù)分析北京地域的清香型大曲微生物多樣性，得出真菌中的優(yōu)勢菌是假絲酵母、曲霉屬等。胡曉龍[4]使用同樣的方法對河南省地域的大曲微生物群落多樣性進(jìn)行分析，得出真菌中優(yōu)勢菌種是扣囊復(fù)膜酵母、雪黃散囊菌等。由此得出不同地域的氣候、地勢環(huán)境、大曲制作方法的不同均可能對大曲中微生物的多樣性產(chǎn)生影響。對于白酒行業(yè)來說，篩選出具有地域特色的高品質(zhì)微生物能提升出酒率和酒的品質(zhì)，進(jìn)而改善傳統(tǒng)制曲工藝。故此，對湖南邵陽地區(qū)的大曲微生物的篩選與研究顯得極為必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

湖南省邵陽市湘窖酒業(yè)有限公司高溫包包曲。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑

（1）培養(yǎng)基。①初始發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、自來水1 L、pH 值7.0，121 ℃滅菌25 min。②初選培養(yǎng)基：玉米淀粉20 g、K2HPO4 1.0 g、NaNO3 3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂粉13 g、氯霉素0.005 g、定容至1 L錐形瓶中，pH值 5.5～6.0，121 ℃滅菌25 min。③馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。④YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，115 ℃濕熱滅菌20 min。

（2）試劑。硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、麥芽糖、3，5-二硝基水楊酸、酵母膏和瓊脂粉等由邵陽學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室提供;氯霉素購于藥店。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

LE438型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司;UV-3802型紫外分光光度計(jì)：重慶萬達(dá)儀器有限公司;H21-6型電熱恒溫水浴鍋：北京市東霞電子儀表廠;JI54DWS型高壓蒸汽滅菌鍋：致微廈門儀器有限公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大曲發(fā)酵

取1 g大曲接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，40 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩

取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，于99 mL的無菌水三角瓶中，振蕩均勻，即為稀釋度10-2的粉末懸液。再依次進(jìn)行梯度稀釋，獲得稀釋度為10-3、10-4、10-5和10-6的大曲稀釋液。分別取10-4、10-5、10-6稀釋液0.1 mL涂布于篩選平板上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進(jìn)行平板劃線，得到單個(gè)菌落。噴灑碘液，若菌落出現(xiàn)白色透明圈，則說明此菌可產(chǎn)生淀粉酶，挑選有透明圈的菌落備用，并制作表格統(tǒng)計(jì)D/d值，初步篩選產(chǎn)淀粉酶菌株。

1.2.3 菌株復(fù)篩

高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選：將初篩出的純菌種接種于250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)2 d。取發(fā)酵液1 mL于8 000 r/min下離心10 min，取上清液測酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 耐酸性篩選

將篩選出的兩株高產(chǎn)性菌株分別同時(shí)接種于YPED液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，種子活化液濃度為1.0×107 CFU/mL，設(shè)置5個(gè)不同梯度的pH值，pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0和4.5，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，吸取2×105 CFU/mL菌液1 mL于上述不同pH值的100 mL YPED液體培養(yǎng)基中，利用紫外分光光度計(jì)測定560 nm下菌液的OD值，OD值越大，菌株的耐酸性越強(qiáng)[5-6]。

1.2.5 酶活測定方法

（1）測定方法。采用DNS法[7]測菌株的酶活力，以麥芽糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定試驗(yàn)菌株在520 nm的吸光度。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。①取16支潔凈比色管分別編號1、2、3、4、5和6（除6號試管1支外，其他每組編號各3支），用蒸餾水沖洗，于培養(yǎng)箱中烘干，之后分別往比色管中依次加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL和2.0 mL麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，DNS指示劑，蒸餾水（加入量參考文獻(xiàn)[8]）。②搖勻后于沸水中加熱5 min，冷卻后，各試管用蒸餾水定容至25 mL，試管6作為對照組，其他組平行試驗(yàn)3次且結(jié)果取平均值。③測定試驗(yàn)菌株在520 nm的吸光度，以麥芽糖量為橫坐標(biāo)，吸光光度值為縱坐標(biāo)，得到麥芽糖含量的回歸方程。

（3）酶活力單位定義。在40 ℃、pH值 6.0的條件下，每分鐘從1%的可溶性淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）[9]。

1.2.6 菌落形態(tài)觀察

將初篩后的菌株平板劃線，純化，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用美藍(lán)與棉藍(lán)溶液分別對酵母菌與霉菌進(jìn)行鏡檢。觀察平板中菌落的顏色、大小、表面的粗糙程度、鏡檢下的孢子形態(tài)以及菌株菌絲狀態(tài)等，并且參照《真菌鑒定手冊》[10]進(jìn)行比較。

1.2.7 菌株生物學(xué)特性測定

（1）溫度對菌株產(chǎn)淀粉酶能力的影響。將待測菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃ 5個(gè)溫度下培養(yǎng)，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d，取2 mL酶液進(jìn)行酶活性測定。每組設(shè)3個(gè)平行樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值[11]。

（2）酒精濃度對菌株產(chǎn)淀粉酶能力的影響。以5%的菌液種量接種到酒精濃度為2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培養(yǎng)基中，在28 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2～3 d，取2 mL酶液進(jìn)行酶活性測定。每組設(shè)3個(gè)平行樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

（3）酸堿度對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響。以5%的菌液接種量接種到pH值 2.5、pH值 3.0、pH值 3.5、pH值 4.0和pH值 4.5的高粱汁培養(yǎng)基中，在28 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2～3 d，取2 mL酶液進(jìn)行酶活性測定。每組設(shè)3個(gè)平行樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸、高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選結(jié)果

2.1.1 淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，該方程為y=0.268 9x+0.0565 5，R2=0.991 9。

2.1.2 高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

從大曲中初篩分離得13株菌株，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色與菌落形態(tài)，初步觀察判定為酵母菌、毛霉、青霉與黃曲霉，因黃曲霉會產(chǎn)生黃曲霉毒素，其是一類有毒的次生代謝產(chǎn)物，且廣泛存在于農(nóng)作物及食物中，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為“Ⅰ”類致癌物，故復(fù)篩時(shí)將黃曲霉剔除，選取酵母菌、毛霉與青霉中透明圈直徑與菌落直徑較大的3株菌株進(jìn)行復(fù)篩，測定其酶活性[12]。由表1可知，WB4與WB9的酶活性最高，說明這兩株菌株的產(chǎn)酶能力較好。

2.1.3 耐酸淀粉酶的篩選

將WB4與WB9分別接種于pH為2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的YEPD培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)3 d。由表2可知，在波長560 nm下，且pH在2.5～4.5，隨著pH的變化，WB4與WB9的OD值至均高于前一梯度的OD值。傳統(tǒng)釀酒工藝中，在糖化之前需將醪液pH值由6.5降到4.5，以便糖化酶活性的最大化。因pH在4.5的條件下，WB4的酶活性更高，故WB4即為所要篩選耐酸、高產(chǎn)淀粉酶微生物。耐酸性以及酶活結(jié)果如表2所示。

2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株形態(tài)學(xué)鑒定

從初選培養(yǎng)基中分離出3種不同形態(tài)的菌株，再進(jìn)行純化，觀察菌落形態(tài)與孢子特征，如圖2所示。由圖2可知，在28 ℃條件下，將菌株WB4、WB9、WB13培養(yǎng)3 d，其中WB4與WB13菌落呈乳白色，表面呈圓形且凸起，菌落較小，邊緣較為規(guī)則，菌落中單個(gè)細(xì)胞寬度約2～3 nm，長度5～6 nm，呈橢圓形，初步鑒定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。WB9菌落呈雪白色，表面黏稠、濕潤，邊緣不規(guī)整，菌落較大，菌落中單個(gè)細(xì)胞直徑約2～3 nm，呈卵圓狀，初步鑒定為粉狀米勒酵母（Millerozy mafarinose）。實(shí)驗(yàn)菌株形態(tài)特征與《真菌鑒定手冊》和文獻(xiàn)[13]鑒定結(jié)果一致。

（a）WB9的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及分生孢子形態(tài)

（b）WB4的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及分生孢子形態(tài)

（c）WB13的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及分生孢子形態(tài)

圖片從左至右依次為菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)（×100）及分生孢子（×400）形態(tài)圖。

2.3 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 溫度對菌株WB4產(chǎn)淀粉酶能力的影響

將菌株分別在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃與

40 ℃ 5個(gè)溫度下培養(yǎng)2 d后，用DNS法測定其酶活性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株WB4在32 ℃時(shí)，酶活性最高，平均OD值為2.877;當(dāng)溫度低于32 ℃時(shí)，菌株的酶活性相較之下較低;當(dāng)溫度高于32 ℃時(shí)，酶活性顯著降低。因此，確定菌株WB4的最適溫度為32 ℃。

2.3.2 酒精濃度對菌株WB4產(chǎn)淀粉酶能力的影響

將WB4的種子液加入含有100 mL的酒精濃度為2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培養(yǎng)基的錐形瓶中，貼好標(biāo)簽，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，用DNS法測定其酶活性，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)酒精濃度在2%～8%時(shí)，WB4菌的OD值是緩慢下降，但酒精濃度在8%～10%時(shí)，WB4的OD值下降較快。因此，WB4菌株的耐酒精濃度為10%。

3 結(jié)論

本研究從湖南省湘窖酒業(yè)有限公司中高溫包包曲中篩選出13株產(chǎn)淀粉酶的菌株，并對這13株菌株進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)觀察，判定為酵母菌、毛霉、青霉與黃曲霉4種菌株，因?yàn)辄S曲霉會產(chǎn)生黃曲霉毒素，故不進(jìn)行后續(xù)操作;其他菌株通過酶活性大小鑒定，得WB4與WB9這兩株菌株的產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng);將WB4與WB9這兩株菌株接種于YPED液體培養(yǎng)基中，再通過DNS法對其進(jìn)行酶活性大小比較，最終獲得一株耐酸、高產(chǎn)淀粉酶菌株WB4;經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察，鑒定該菌株為釀酒酵母;通過液體發(fā)酵法確定該菌株產(chǎn)酶的最佳條件為：溫度為32 ℃，酒精濃度為10%。本試驗(yàn)通過篩選耐酸性和高產(chǎn)性的釀酒微生物，有效解決了釀酒糖化過程前的酸堿調(diào)節(jié)問題，減少釀酒過程中不必要的環(huán)節(jié)，節(jié)約了時(shí)間，能夠有效提高工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)酒率，降低釀酒生產(chǎn)成本。

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基金項(xiàng)目：湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（湘教通〔2020〕191號-3406）;國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S202010547049）。

作者簡介：陳闊（2001—），男，湖南長沙人，本科在讀。研究方向：微生物。

通信作者：尹樂斌（1982—），男，江西樂安人，博士，副教授。研究方向：果蔬加工。E-mail：112608803@qq.com。