， ，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

藥物篩選是指利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法和技術(shù)，建立合適的篩選模型，從可能作為藥物使用的天然或合成化合物中得到高效的先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行藥理及藥效活性的檢測(cè)，評(píng)價(jià)某一化合物的藥用前景的方法，是新藥研發(fā)中縮短時(shí)間、減少成本和降低風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵步驟[1-2].雖然藥物的吸收、分布和毒理等研究在過去20 年里有重大進(jìn)展，但根據(jù)生物技術(shù)創(chuàng)新組織(BIO)2016年發(fā)布的報(bào)告顯示，過去10 年間候選藥物獲得批準(zhǔn)并投放市場(chǎng)的總體可能性僅為10%左右[3]，如此高的淘汰率使作為新藥研發(fā)源頭的篩選工作成為醫(yī)藥行業(yè)一個(gè)重要的亟需突破的瓶頸[4-5].提高藥物篩選的質(zhì)量和降低費(fèi)用在藥物研發(fā)過程中至關(guān)重要[6].過去的半個(gè)世紀(jì)，藥物篩選經(jīng)歷了從動(dòng)物表型到分子再到細(xì)胞的過程.早期的整體動(dòng)物篩選模型利用患病動(dòng)物建模進(jìn)行化合物的初篩、復(fù)篩和檢驗(yàn).通過表型直接觀察目標(biāo)化合物的作用情況，不但過程復(fù)雜、耗資巨大，而且存在病理部位和藥物作用機(jī)制不明確等缺點(diǎn).隨著現(xiàn)代分子藥理學(xué)研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)功能蛋白質(zhì)、生物活性成分在調(diào)節(jié)生命活動(dòng)方面所起的重要作用，為藥物篩選提供了新的方法和機(jī)會(huì).以分子配基作為受體靶點(diǎn)的分子水平藥物篩選模型逐漸成為使用范圍最廣、技術(shù)最成熟的篩選方法之一.該方法使藥物的作用靶點(diǎn)清晰，但仍存在規(guī)模小、效率低等不足之處.基于傳統(tǒng)篩選方法的缺陷，并隨著細(xì)胞生物學(xué)和基因工程等學(xué)科的發(fā)展，細(xì)胞水平藥物篩選逐漸成熟.以細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)，不僅可以考察藥物的作用效果，明確作用靶點(diǎn)，還可以通過細(xì)胞的增值、衰亡以及胞內(nèi)外環(huán)境的變化特征得到藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]、保留[8-9]和代謝[10]等動(dòng)力學(xué)參數(shù)[11]，具有微量、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的特點(diǎn)，是目前使用較為成熟和廣泛的一類方法.

傳統(tǒng)的細(xì)胞篩選模型所利用的細(xì)胞通常是由病理部位細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)等手段得到的單層細(xì)胞或單細(xì)胞的懸浮液，呈平面生長(zhǎng)，缺乏細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的接觸[12]，細(xì)胞所處的環(huán)境與實(shí)體微環(huán)境截然不同.同氨基酸的盤曲折疊形成不同構(gòu)象的蛋白質(zhì)功能不同一樣，細(xì)胞的堆積方式不同，它的特性也不盡相同，通過普通的平面2D細(xì)胞篩選得到的結(jié)果不能非常準(zhǔn)確地反應(yīng)藥物在人體內(nèi)的作用效果.例如，多年來(lái)癌癥藥物的發(fā)現(xiàn)主要是基于它對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力和精確抑制癌細(xì)胞基因的能力，這些化合物在使腫瘤部分或完全消退的同時(shí)，會(huì)伴隨著大量的細(xì)胞毒性累積[13].而利用2D篩選模型得到的抗癌藥物在殺滅病理細(xì)胞之后，積累的毒性可能會(huì)轉(zhuǎn)而攻擊周圍的正常細(xì)胞.這使得大部分的抗癌藥物后期都無(wú)法通過臨床試驗(yàn)，浪費(fèi)了大量的人力、物力與時(shí)間.所以，2D細(xì)胞篩選模型已經(jīng)無(wú)法滿足人們的需要.隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，人們致力于開發(fā)能更好地代表體內(nèi)生物學(xué)的3D培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)腫瘤、心臟和肝臟等模型[14-15]，同時(shí)更趨向于大批量和小型化[3].3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是將合適的載體與組織細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，使細(xì)胞在特定的空間結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)、遷移和分化，形成組織特性，最大程度模擬組織生理作用及其周圍內(nèi)環(huán)境.下面介紹幾種最常見的疾病的3D篩選模型.

1 不同疾病的3D細(xì)胞篩選模型

1.1 腫瘤藥物的3D細(xì)胞篩選模型

多細(xì)胞癌癥腫瘤球模型(MCTS)是3D培養(yǎng)技術(shù)最典型的模型之一.根據(jù)形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)的變化表明：MCTS是一個(gè)通過細(xì)胞之間的相互交聯(lián)聚合而成的以氧梯度、葡萄糖分布、乳酸積累、DNA鏈斷裂、ATP分布和組織形態(tài)學(xué)擴(kuò)散為特征的完整的無(wú)血管體外腫瘤生長(zhǎng)病理模型[16-19].MCTS的優(yōu)勢(shì)之一在于既有癌變細(xì)胞，癌變細(xì)胞的周圍也有正常細(xì)胞.當(dāng)球狀體細(xì)胞達(dá)到一種臨界直徑時(shí)，它們便開始形成外部延伸區(qū)域、內(nèi)部靜止區(qū)域以及中央壞死區(qū)域，這些模型可以清晰地模仿癌癥細(xì)胞的各種特征.使用MCTS模型，研究者可以揭示癌癥藥物如何滲透到異質(zhì)腫瘤的3D結(jié)構(gòu)中，并且可以揭示藥物如何與腫瘤附近環(huán)境發(fā)生作用.研究表明：當(dāng)球狀體直徑為400 μm時(shí)對(duì)內(nèi)核的增值、再生、耐藥性最理想[3].目前，最先進(jìn)的3D分析技術(shù)可以用來(lái)評(píng)估腫瘤多細(xì)胞球體增殖和血管再生.Wang等[20]建立了在殼聚糖/膠原/海藻酸纖維支架(CCA)上培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞運(yùn)用于抗癌藥物篩選的MCTS模型，發(fā)現(xiàn)與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞有更佳的耐藥性和增值率，其新陳代謝也更接近體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞模式.

李丹丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)：3D培養(yǎng)條件下的細(xì)胞模型具有更好的糖原儲(chǔ)存能力，更高的敏感性.與2D模型相比，3D模型的藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、核受體等的表達(dá)能力均有一定水平的提高.在3D培養(yǎng)條件下的細(xì)胞可更好地維持其極化狀態(tài)，保持組織特有的功能[22-24].Smalley等[25]的研究表明：腫瘤細(xì)胞在2D與3D培養(yǎng)條件下RNA水平會(huì)出現(xiàn)數(shù)百個(gè)片段的差異.利用3D培養(yǎng)技術(shù)得到的模型可與LC-MS、細(xì)胞芯片和免疫組化技術(shù)等檢測(cè)手段相結(jié)合[26-27]，通過觀察藥物對(duì)細(xì)胞的病理作用和毒性，篩選特定化合物.牟朝麗[28]利用PHC多孔支架與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)得到的細(xì)胞反應(yīng)器與LC-MS聯(lián)用，從朱砂七提取物中篩選出可與癌細(xì)胞特異性結(jié)合的馬兜磷酸A和馬兜磷酸B，并從中藥桃兒七中篩選出了7種與癌細(xì)胞特異性結(jié)合的活性產(chǎn)物.

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是存在于惡性腫瘤細(xì)胞中為數(shù)極少卻具有無(wú)限增殖、分化并具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞，它通過自身功能維持腫瘤微環(huán)境的不斷更新，并且具有較強(qiáng)的耐藥性.而3D培養(yǎng)的CSCs球體可以在體外激發(fā)其基因表達(dá)、腫瘤異質(zhì)性和耐藥性等功能，賦予模擬CSCs在生理中的能力，這樣特殊的功能使得CSCs成為非常合適用以檢測(cè)化合物對(duì)其抑制作用的體外功能系統(tǒng)[29-31].Subedi等[9]利用多功能干細(xì)胞(iPS)誘導(dǎo)CSCs，建立人工誘導(dǎo)型腫瘤干細(xì)胞(iCSCL)篩選平臺(tái)，對(duì)6 000 種化合物進(jìn)行了大規(guī)模篩選.由iPS誘導(dǎo)的CSCs具有癌細(xì)胞的特征并且可以穩(wěn)定繁殖，可以用于CSCs的藥物篩選.該研究從6 000 種化合物中初步篩選出了86 種對(duì)腫瘤可能有抑制效果的化合物，發(fā)現(xiàn)線粒體代謝功能障礙對(duì)癌細(xì)胞的抑制有重要作用，最終確定了青蒿琥酯可以通過誘導(dǎo)線粒體功能異常，從而抑制CSCs的繁殖擴(kuò)散.除此之外，研究者們還通過蛋白質(zhì)印記分析了Sox2基因在單層腫瘤細(xì)胞和球狀腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)能力，發(fā)現(xiàn)該基因在腫瘤球體中的表達(dá)明顯高于在單層細(xì)胞中的表達(dá).并且，iCSCL球體腫瘤對(duì)CSCs抑制劑鹽霉素也更加敏感，表明iCSCL球體腫瘤比單層腫瘤細(xì)胞更適合于評(píng)估CSCs抑制劑的功效和選擇性.

1.2 心血管疾病的3D細(xì)胞篩選模型

3D細(xì)胞篩選模型除了運(yùn)用于腫瘤藥物篩選外，研究者們也在嘗試建立心肌細(xì)胞模型來(lái)檢測(cè)具有心臟毒性的化合物[32].自從多功能心肌干細(xì)胞出現(xiàn)以來(lái)已成功構(gòu)建了多種形式的3D心臟模型.心臟是人體內(nèi)最重要的器官之一，負(fù)責(zé)提供壓力使血液攜帶氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流向人體的各個(gè)部位.由于心肌細(xì)胞的再生能力低、自我修復(fù)力較差，使得心血管類的疾病成為世界范圍性的最主要的致死疾病之一[33].除了心臟本身的疾病外，糖尿病及各種炎癥治療過程中各種藥物的代謝副產(chǎn)物會(huì)隨著血液流向心臟，對(duì)心臟產(chǎn)生毒性.這種情況在藥物初步篩選過程中無(wú)法預(yù)估，導(dǎo)致許多化合物最終無(wú)法成藥.現(xiàn)有的藥物篩選平臺(tái)中，通常使用的小鼠模型在電生理特性、耐藥性和抗毒性等方面與人類心臟存在種屬差異[34]，并且存在周期過長(zhǎng)等缺點(diǎn).普通的高通量篩選等體外篩選方法與人體內(nèi)環(huán)境在酸堿性、滲透壓、化學(xué)組成等方面差異巨大，導(dǎo)致篩選準(zhǔn)確性較低.基于體外篩選模型的缺陷，人們研究并建立了體外心臟3D模型[32].模仿天然心肌的3D組織的構(gòu)建需要合適的細(xì)胞來(lái)源與可以支撐細(xì)胞生存、延展，并與宿主整合和血管化的生物材料[35].胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性.這些特性使由人胚胎干細(xì)胞分化得到的心肌細(xì)胞(hESC-CM)成為再生醫(yī)學(xué)和疾病模型非常重要且有前途的細(xì)胞來(lái)源[36].在心臟模型中嵌入的hESC-CM的收縮性和舒張性可以反映藥物對(duì)心臟的作用[37]，而誘導(dǎo)性多功能心肌干細(xì)胞(hiPSC-CMs)可誘導(dǎo)患者自身體細(xì)胞形成iPSCs，具有潛在的疾病源特質(zhì)，因此非常適合作為藥物篩選模型[38].在國(guó)內(nèi)，王慧玲等[39]已在Atelocollagen膠原支架上成功培養(yǎng)出了具有收縮功能的成年大鼠心肌細(xì)胞.Zhang[36]通過在膠原生物材料中包裹hESC-CM制造心肌纖維建立3D心臟模型，并發(fā)現(xiàn)在3D組織基質(zhì)中添加hESC-CM和成纖維細(xì)胞可以促進(jìn)心臟組織在結(jié)構(gòu)上的成熟，建立的3D模型可以用于體外心臟成熟研究.在國(guó)際上，Serpooshan等[40]利用法拉第波使hiPSC-CMs迅速聚合成預(yù)先設(shè)置的三維結(jié)構(gòu).與天然心肌相比，在相同的細(xì)胞密度下，這些hiPSC-CM衍生的3D組織顯示出更好的細(xì)胞存活力、代謝活性和細(xì)胞間連接力.

目前，通過細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程構(gòu)建3D心臟模型的手段以趨于成熟，也已經(jīng)用于再生醫(yī)學(xué)、器官移植和藥物測(cè)試等多方面的研究，相信不久以后，用于篩選的3D心臟模型會(huì)成為心血管類疾病治療藥物的主要篩選方法.

1.3 藥物毒性評(píng)價(jià)的3D細(xì)胞篩選模型

藥物研發(fā)的過程中，新藥的毒性以及耐藥性的評(píng)價(jià)是極其重要的一步.藥物毒性的檢測(cè)一般是在體外細(xì)胞的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，但單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)過于簡(jiǎn)單，不能模擬藥物所作用的實(shí)體三維空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致研究結(jié)果與其在患者體內(nèi)臨床評(píng)估的藥效存在很大的偏差，造成體外培養(yǎng)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床參考意義受限，無(wú)法真實(shí)反映體內(nèi)病理生理結(jié)構(gòu)及狀態(tài)[41-43].因此學(xué)者們致力于開發(fā)3D藥物毒性評(píng)價(jià)的篩選模型以彌補(bǔ)2D細(xì)胞模型的不足.洪少馥[44]利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法成功建立了人乳腺癌MCF-7和人鼻咽癌5-8F 3D腫瘤球模型，并且分別檢測(cè)了兩種腫瘤球與其同一類型單層細(xì)胞在細(xì)胞耐藥、周期、藥物敏感性和乏氧基因等方面的差異，結(jié)果顯示形成腫瘤球后細(xì)胞的耐藥性能增強(qiáng)，并且3D立體結(jié)構(gòu)賦予了MCF-7和5-8F腫瘤球與體內(nèi)實(shí)體腫瘤非常相似的乏氧特征.同時(shí)考察了超聲福照聯(lián)合紫杉醇在腫瘤球模型上的細(xì)胞毒性效應(yīng)，證明了超聲福照在適宜條件下可輔助増強(qiáng)腫瘤球?qū)ψ仙即嫉乃幬锩舾行?

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)作為引起急慢性肝損傷和爆發(fā)性肝衰竭的主要因素，是影響新藥安全的重要方面，也是研發(fā)者在新藥開發(fā)過程中必須檢測(cè)的項(xiàng)目.有研究表明：在德國(guó)和法國(guó)，由藥物原因造成的肝損傷分別占肝病患者的32%和40%.許多藥物臨床失敗、上市后撤回的主要原因之一就是DILI，這一點(diǎn)造成了資源與金錢的極大浪費(fèi)，所以盡可能早地檢測(cè)出藥物的肝毒性至關(guān)重要[45].Tania等[46]以聚二甲基硅氧烷 (PDMS)為支架材料三維培養(yǎng)肝細(xì)胞，并將其整合到特定的生物反應(yīng)器中以改善細(xì)胞培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)和氣體供應(yīng)，通過產(chǎn)生的白蛋白和尿素來(lái)評(píng)估該模型的肝臟特異性功能，并以對(duì)乙酰氨基酚來(lái)對(duì)其安全性評(píng)價(jià)能力進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該模型的肝細(xì)胞彼此之間接觸良好，在培養(yǎng)期間非常好地維持了培養(yǎng)物特異性酶功能，并且能夠很好地用于臨床前早期肝毒性的檢測(cè).

1.4 3D細(xì)胞模型的應(yīng)用——芯片實(shí)驗(yàn)室

20世紀(jì)末，Harrison等[47]將毛細(xì)管電泳和樣品注射系統(tǒng)集成到平面玻璃芯片上，首次提出以微機(jī)電加工技術(shù)為基礎(chǔ)的“微型全分析系統(tǒng)”，即現(xiàn)在的芯片實(shí)驗(yàn)室.芯片實(shí)驗(yàn)室，指將樣品反應(yīng)、制備、分離、檢測(cè)等基本操作集成到一塊芯片上，在微通道內(nèi)對(duì)納升甚至皮升量級(jí)的液體進(jìn)行精確操作以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析的技術(shù)[48].芯片實(shí)驗(yàn)室用于藥物的評(píng)價(jià)和篩選，具有快速、準(zhǔn)確、便捷和高通量的特點(diǎn).Choucha等[49]以HepG2/C3a細(xì)胞為研究對(duì)象，建立了肝癌模型的芯片實(shí)驗(yàn)室，并檢測(cè)了癌細(xì)胞對(duì)氟他胺、羥基氟他胺的代謝應(yīng)答，以探索前體藥物的體外代謝過程和發(fā)揮抗腫瘤活性的二級(jí)代謝產(chǎn)物的毒理學(xué)特性.Choucha的HepG2/C3a細(xì)胞模型將芯片實(shí)驗(yàn)室這一新技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)、藥物毒性檢測(cè)等傳統(tǒng)藥物評(píng)價(jià)手段相結(jié)合，在新藥研發(fā)領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，并且為體外藥物評(píng)價(jià)與篩選提供了新的平臺(tái).

除單純的藥物篩選外，芯片實(shí)驗(yàn)室還可用于組織與器官的仿生建立.Huh等[50]從人的氣孔和肺血管內(nèi)皮同時(shí)提取細(xì)胞并置于膜的兩側(cè)培養(yǎng)，中間有培養(yǎng)介質(zhì)通過，由此構(gòu)建了一個(gè)仿生組織模仿肺泡-毛細(xì)血管界面.然后通過在組織兩側(cè)加裝側(cè)孔施以負(fù)壓使整個(gè)結(jié)構(gòu)可以模仿人呼吸一樣舒張和收縮.通過以上方法可以將兩種或兩種以上的組織放在一起，創(chuàng)造出類似于人工器官的可稱為芯片實(shí)驗(yàn)室的仿生模型.該模型具備了人工器官的基本特征，可以顯示出與人體器官內(nèi)相似的功能.這樣的仿生模型雖然不能直接代替人工器官用于器官移植，但基本適用于疾病診斷、藥物合成與篩選等領(lǐng)域.

2 結(jié) 論

3D細(xì)胞培養(yǎng)通過運(yùn)用再造細(xì)胞外基質(zhì)，能夠模擬細(xì)胞在生物體內(nèi)的生存環(huán)境，為細(xì)胞提供一個(gè)更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境，同時(shí)又能彌補(bǔ)在體內(nèi)或2D條件下不能更好地對(duì)藥效進(jìn)行觀察的缺陷.采用3D細(xì)胞作為藥物篩選的模型，主要有幾下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1) 與整體動(dòng)物模型和組織器官模型相比，細(xì)胞模型的建模周期短且過程較為簡(jiǎn)便，可有效縮短篩選時(shí)間，節(jié)省人力、物力；2) 避免了因種屬不同導(dǎo)致的藥物在代謝及毒性方面的差異，排除了生理屏障對(duì)藥物吸收的影響[51]，從源頭降低了新藥在臨床試驗(yàn)中失敗的概率；3) 作用靶點(diǎn)明確，與高通量篩選、高內(nèi)涵篩選等自動(dòng)化的現(xiàn)代篩選手段結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、多指標(biāo)及多通道篩選，提高篩選效率；4) 細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化反應(yīng)靈敏，可以檢測(cè)出復(fù)雜成分中極少量的目標(biāo)化合物，具有微量化、高靈敏度等明顯優(yōu)勢(shì).雖然細(xì)胞篩選模型相對(duì)于動(dòng)物或組織篩選模型有許多優(yōu)勢(shì)，但也仍然存在很多需要解決的問題.例如，由于細(xì)胞感知外界環(huán)境變化的能力，導(dǎo)致其對(duì)溫度、酸堿性和濕度環(huán)境等要求非常高，很小的變化都有可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡或變異.另外，3D細(xì)胞模型仍處于發(fā)展?fàn)顟B(tài)，目前的技術(shù)還僅僅停留在建模水平，只有極少數(shù)的模型被證明可用于藥物篩選.與此同時(shí)，3D細(xì)胞模型雖然解決了空間差異對(duì)藥物活性的影響，但與2D細(xì)胞模型一樣，無(wú)法篩選出不能穿過血腦屏障等人體防御系統(tǒng)的化合物.此類化合物可以有效作用于細(xì)胞靶點(diǎn)，但是在人體中無(wú)法直達(dá)病理部位，在一定程度上限制了細(xì)胞篩選模型的發(fā)展.對(duì)于如何克服細(xì)胞篩選模型的這些缺陷目前還有待研究，但相信隨著3D細(xì)胞及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，這些問題都可以一一解決，3D細(xì)胞模型會(huì)有更廣闊的發(fā)展.同時(shí)，也將會(huì)有更多種類的細(xì)胞用于不同篩選模型的構(gòu)建.

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