,, ,,,
(1.臨安區(qū)環(huán)境監(jiān)測站,浙江 杭州 311300;2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)
國外的液泵型生物反應(yīng)器(Loop reactor),因其產(chǎn)生的動力,即液泵置于生物反應(yīng)器外部,輸送液體的泵通過管道與反應(yīng)器(或稱發(fā)酵罐)連接,使反應(yīng)器內(nèi)的液體(料液)與器外的管道形成一個環(huán)流,而空氣通過另一路管道通入反應(yīng)器中,使液體和空氣充分混合.這種液泵型生物反應(yīng)器屬外循環(huán)反應(yīng)器,其優(yōu)點是結(jié)構(gòu)簡單,傳熱、傳質(zhì)速率快[1-4],但它最大的缺點是泵暴露在反應(yīng)器外面,無法進(jìn)行密封無菌操作,因此很容易染菌.近10 年來,浙江工業(yè)大學(xué)和鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備有限公司合作研制出了內(nèi)循環(huán)下噴式液泵型生物反應(yīng)器,即將耐熱泵置于反應(yīng)器內(nèi),反應(yīng)器中還設(shè)計了射流閥和導(dǎo)流筒,以下噴式形式射向罐底,射流閥噴出的流體從罐底返回時液體從導(dǎo)流筒的中間與外邊分別翻起,加劇了液體的湍動,增加了液體的溶解氧,有利于工業(yè)微生物的生長和繁殖.筆者測試了20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器在不同通風(fēng)比(0.462,0.615,0.846)和不同循環(huán)液速(2.71,2.38,2.01,1.64 L/min)下容積氧傳遞系數(shù)KLa的變化規(guī)律,并與3 L攪拌式生物反應(yīng)器(即通用發(fā)酵罐)BioFlo110作對比試驗.筆者試驗了β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌黑曲霉315在該反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵代謝情況,并與3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110作對比.
紫外/可見分光光度計751GD,上海市儀器分析一廠;下噴式液泵型20 L生物反應(yīng)器,鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備公司; 3 L攪拌式反應(yīng)器BioFlo 110,New Brunwick Scientific;HYG-A回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜,江蘇太倉市實驗設(shè)備廠.
1.2.1 亞硫酸鈉氧化法測定溶氧傳質(zhì)系數(shù)KLa
1) 亞硫酸鈉氧化法
溶氧傳質(zhì)系數(shù)KLa的測定方法采用亞硫酸鈉氧化法[5].
2) 溶氧傳質(zhì)性能的對比方法
在相同的操作壓力(0.1 MPa)和操作溫度(25 ℃)下,利用亞硫酸鈉氧化法分別測定兩個反應(yīng)器在不同的通風(fēng)比和不同轉(zhuǎn)速(液泵型反應(yīng)器對應(yīng)為循環(huán)液速)下的容積氧傳遞系數(shù)的大小,并初步選擇通風(fēng)比和轉(zhuǎn)速,使兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)大小相近.然后在轉(zhuǎn)速和其他條件不變的情況下,只改變通風(fēng)比,測定兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù);同時在通風(fēng)比和其他條件不變的情況下,只改變轉(zhuǎn)速,測定兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù); 根據(jù)所測容積氧傳遞系數(shù),必能找出一組條件,使兩反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)相近,以此作為兩反應(yīng)器發(fā)酵性能對比的依據(jù).
1.2.2 菌種與培養(yǎng)基
1) 菌 種
黑曲霉315(A.Niger315)由實驗室提供.
2) 培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉10 g/L,小麥粉10 g/L,豆餅粉30 g/L.
3) 酶活的測定
β-葡聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考文獻(xiàn)[6].β-葡聚糖酶活力測定方法:以大麥β-葡聚糖為底物,采用DNS光電比色法測定.酶活單位定義:以β-葡聚糖為底物,采用DNS顯色,光電比色法,在pH=7.0,溫度40 ℃條件下,1 min使底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需的量,定義為一個單位(U).β-葡聚糖酶活力單位(U/mL)=r×Df/t,其中:r為與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液相對應(yīng)的質(zhì)量濃度(μg/mL);Df為待測酶液的稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時間(5 min).
樣品測定:待測酶液用蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù),取經(jīng)40 ℃預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的β-葡萄糖溶液1.0 mL,混勻,再加入3 mL DNS試劑,然后沸水加熱5 min,待冷卻至室溫后測定OD值.
空白制作:取蒸餾水1 mL,先加入DNS試劑3.0 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的β-葡萄糖溶液1.0 mL,再加入水加熱5 min,待冷卻后,測定OD值.
2.1.1 液泵型反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律的測試
表120L下噴式液泵型生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律測試實驗
Table1TransfomationregulationofKLain20LJLRreactor
序列號通風(fēng)比vvm/(L·L-1·min-1)液泵轉(zhuǎn)速/(r·min-1)KLa/h-110.462∶180058.420.462∶1100076.130.462∶1120095.240.462∶11400111.450.615∶11200109.560.846∶11200120.970.615∶11400148.580.846∶11400173.3
當(dāng)通風(fēng)比一定時(0.462∶1),液泵型反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著液泵轉(zhuǎn)速的增大而明顯增大,且有一定的線性關(guān)系.該反應(yīng)器的液泵轉(zhuǎn)速對應(yīng)著液噴速度的大小,當(dāng)通風(fēng)比一定時,增大液噴速度有利于減小氣泡直徑和氣體在水里的分散,從而容積氧傳遞系數(shù)明顯增大.通風(fēng)比一定時(0.462∶1),KLa與液泵轉(zhuǎn)速的關(guān)系曲線線性度較高,這可能是由于在低通風(fēng)比(且通風(fēng)比一定)時,容積氧傳遞系數(shù)與液噴速度幾乎成正比關(guān)系,也就是容積氧傳遞系數(shù)KLa與氣、液噴速度的關(guān)聯(lián)式中,液噴速度的指數(shù)接近于1.
當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速一定時,該反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比的增大而增大,但無線性關(guān)系.這是因為增大通風(fēng)比有利于增大持氣率和擴(kuò)大氣液界面面積,而增大持氣率和擴(kuò)大氣液界面面積均有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa.當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速為1 200 r/min時,容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比的變化不如液泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min時顯著,這說明在低液噴速度時,通風(fēng)比的變化對容積氧傳遞系數(shù)KLa的影響不顯著,此時液噴速度是瓶頸.
2.1.2 液泵型反應(yīng)器的液泵轉(zhuǎn)速與循環(huán)液速之間的關(guān)系
用自來水將反應(yīng)器注滿,即在反應(yīng)器內(nèi)裝入20 L水,調(diào)節(jié)并設(shè)置液泵轉(zhuǎn)速為800 r/min,待顯示屏的轉(zhuǎn)速讀數(shù)穩(wěn)定在800 r/min時,再往反應(yīng)器內(nèi)加水,直至加滿,準(zhǔn)備好秒表,在打開排料閥門的同時按下秒表開始記時,當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)水排完的瞬間按一下秒表,結(jié)束記時.照此,改變轉(zhuǎn)速為1 000,1 200,1 400,1600 r/min,進(jìn)行重復(fù)試驗,結(jié)果見表2.
表220L下噴式液泵型生物反應(yīng)器液泵轉(zhuǎn)速與循環(huán)液速關(guān)系
Table2Relationshipbetweenpump’sagitationandliguidcircularratein20LJLPreactor
序列號液泵轉(zhuǎn)速/(r·min-1)循環(huán)周期/min循環(huán)液速/(L·min-1)平均循環(huán)液速/(L·min-1)6.503.0818006.433.113.096.483.087.402.70210007.352.722.717.362.718.412.38312008.482.363.388.342.399.962.014140010.051.992.019.812.0412.181.645160012.241.631.6412.201.65
表2反映了液泵轉(zhuǎn)速與循環(huán)液速之間的關(guān)系,每一個液泵轉(zhuǎn)速必對應(yīng)著一個循環(huán)液速,即兩者有一一對應(yīng)關(guān)系,一般來說液泵轉(zhuǎn)速大,相應(yīng)的循環(huán)液速也較大.
2.1.3 攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律的測試
表3攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律測試實驗表
Table3TransfomationregulationofKLainagitationreactor
序列號通風(fēng)比vvm/(L·L-1·min-1)攪拌轉(zhuǎn)速/(r·min-1)KLa/h-111∶120042.1021∶130051.3031∶140094.4341∶1500157.0551∶1600282.7361.25∶1500162.1071.5∶1500173.20
由表3可知:攪拌式反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比、攪拌轉(zhuǎn)速的變化而變化,且隨它們的增大而增大.當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速一定時,攪拌式反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比的增大而增大,但這一變化不是很顯著.這有可能是在較高的攪拌轉(zhuǎn)速下,影響容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素不再是通風(fēng)量,也就是通風(fēng)量對容積氧傳遞系數(shù)KLa的貢獻(xiàn)不大.當(dāng)通風(fēng)比一定時,增大攪拌轉(zhuǎn)速有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa.但也不難發(fā)現(xiàn)低轉(zhuǎn)速區(qū),增大攪拌轉(zhuǎn)速對容積氧傳遞系數(shù)KLa的提高不如高轉(zhuǎn)速區(qū)顯著.這說明在低轉(zhuǎn)速區(qū),影響容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素不是攪拌轉(zhuǎn)速,通風(fēng)量的影響可能起重要作用.
2.1.4 液泵型生物反應(yīng)器與攪拌式生物反應(yīng)器的對比
由液泵型反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律可知:在溫度和壓力等操作條件一定時,影響液泵型反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素是液泵轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比.當(dāng)通風(fēng)比一定時容積氧傳遞系數(shù)隨液泵轉(zhuǎn)速的變化幾乎成線性關(guān)系;而當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速一定時,容積氧傳遞系數(shù)隨通風(fēng)比的增大而增大,但這一變化的程度取決于液泵轉(zhuǎn)速的大小,在高液泵轉(zhuǎn)速下,這一變化較顯著.
由攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律可知:在溫度和壓力等操作條件一定時,影響攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素是攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比.當(dāng)通風(fēng)比一定時,增大攪拌轉(zhuǎn)速有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa,這一變化在高攪拌轉(zhuǎn)速區(qū)比在低攪拌轉(zhuǎn)速區(qū)顯著.當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速(較高)一定時,增大通風(fēng)比有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa,但這一變化并不顯著.
攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min、通風(fēng)比為1.5∶1的3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110與液泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min、通風(fēng)比為0.846∶1的20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器具有幾乎相同的容積氧傳遞系數(shù)KLa(173.2 h-1).在試驗的系列范圍內(nèi),改變20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器的通風(fēng)比和液泵轉(zhuǎn)速為適當(dāng)值時,能找到一組操作變量(通風(fēng)比和液泵轉(zhuǎn)速)使其容積氧傳遞系數(shù)KLa與3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110的容積氧傳遞系數(shù)KLa相等,這為后述實罐發(fā)酵對比奠定基礎(chǔ).
2.2.1 發(fā)酵過程基本操作
根據(jù)1.2.2節(jié)2)中列出的黑曲霉315生產(chǎn)β-葡聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方要求,分別配制13,1.75 L培養(yǎng)基基質(zhì),加自來水分別稀釋培養(yǎng)基至9,1.75 L(對于20 L反應(yīng)器事先進(jìn)行一次空消,計算出冷卻水體積為4 L),然后分別進(jìn)行一次實罐滅菌操作,待培養(yǎng)基冷卻后,按5%的接種量分別向兩反應(yīng)器接入經(jīng)擴(kuò)培后的黑曲霉315種子液(注意無菌操作的規(guī)范性和嚴(yán)謹(jǐn)性).以兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律的對比試驗得出的使兩反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)相近的一組通風(fēng)比、轉(zhuǎn)速條件作為本次發(fā)酵的通風(fēng)比、轉(zhuǎn)速的條件(液泵型生物反應(yīng)器的液泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min、通風(fēng)比為0.846∶1;攪拌式生物反應(yīng)器的攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min、通風(fēng)比為1.5∶1,而且一直保持到發(fā)酵結(jié)束為止.調(diào)節(jié)兩反應(yīng)器的溫度控制系統(tǒng),控制發(fā)酵溫度在30 ℃,調(diào)節(jié)20 L反應(yīng)器的進(jìn)出口閥門,控制反應(yīng)器內(nèi)的表壓為0.05 MPa,待兩反應(yīng)器基本參數(shù)穩(wěn)定后,開始取樣,開始兩次隔8 h取一次樣,估計16 h以后酶活開始上升,所以以后每隔2 h取一個樣,并盡快對所取的樣品進(jìn)行β-葡聚糖酶酶活的測定.
2.2.2 兩反應(yīng)器中β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌株發(fā)酵結(jié)果
兩發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶代謝曲線見圖1,2.由圖1,2可知:液泵型生物反應(yīng)器發(fā)酵黑曲霉所得的β-葡聚糖酶的酶活優(yōu)于攪拌式反應(yīng)器,而且高峰期提前6 h,并且上升速率(從開始上升到到達(dá)高峰的速度)也較快.分析其原因有以下幾點:1) 黑曲霉為嚴(yán)格的好養(yǎng)菌,在其生長高峰期對氧的需求量特別大,液泵型生物反應(yīng)器利用高速液體射流的動能是其在反應(yīng)器中均勻分散、懸浮,繼而在反應(yīng)器內(nèi)形成整體的環(huán)流,使各相密切接觸,很好地保證了此時黑曲霉對氧的需求;2) 黑曲霉為絲狀真菌,攪拌式反應(yīng)器的攪拌裝置對黑曲霉有較大的剪切力損傷,影響了黑曲霉的生長,導(dǎo)致了酶活的降低,而液泵型生物反應(yīng)器對黑曲霉的剪切力損傷較小,黑曲霉可以正常生長,所以所得的β-葡聚糖酶的酶活也相對較高.
圖1 20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器中酶活變化曲線Fig.1 Time curve of enzymatic activity in 20 L reversed jet loop reactor
圖2 3 L攪拌式生物反應(yīng)器中中酶活變化曲線Fig.2 Time curve of enzymatic activity in 3L universal fermenter
20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)KLa隨通風(fēng)比、液泵轉(zhuǎn)速的提高而增大,且當(dāng)通風(fēng)比一定時,KLa與液泵轉(zhuǎn)速的關(guān)系曲線線性度較高,當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速一定時,低液噴速度時通風(fēng)比的變化對容積氧傳遞系數(shù)KLa的影響不如高液噴速度時顯著.3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比、攪拌轉(zhuǎn)速的增大而增大,且低攪拌轉(zhuǎn)速區(qū)時,增大攪拌轉(zhuǎn)速對容積氧傳遞系數(shù)KLa的提高不如高轉(zhuǎn)速區(qū)時顯著.通過實驗,找到使兩反應(yīng)器的KLa相等的一組操作條件,并為發(fā)
酵條件的控制奠定基礎(chǔ).通過黑曲霉315在兩反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵性能對比,發(fā)現(xiàn)在使兩反應(yīng)器KLa相等的那組操作條件下,兩反應(yīng)器的氧傳速率存在差別,且兩反應(yīng)器的內(nèi)部構(gòu)造存在較大差別,這導(dǎo)致細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)生長環(huán)境的顯著不同,實驗發(fā)現(xiàn)液泵型反應(yīng)器適合黑曲霉等微生物的發(fā)酵代謝,得到的發(fā)酵結(jié)果相對較好,且發(fā)酵時間縮短了6 h,大幅度節(jié)省了能耗.
參考文獻(xiàn):
[1] DUTT N N, RAGHAVAN K V.Mass transfer and hydrodynamic characteristics of loop reactors with down-flowliquid jet ejector[J].Chemical engineering journal, 1987, 36(2): 111-121.
[2] VELAN M, RAMANUJAN T K.Gas-liquid mass transfer in a down flow jep loop reactor[J].Chemical engineering science, 1992,47(9/10/11): 2871-2876.
[3] PADMAVATHI G, RAO K R.Influence of geometry on gas holdup in a reversed flow jet loop reactor[J].Canadian journal of chemical engineering, 1993, 71(1): 94-100.
[4] 王遠(yuǎn)山,朱旭,牛坤,等.一次性生物反應(yīng)器的研究與進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊,2015,44(3):56-64.
[5] 李永祥,程振民,蔣正興,等.三相下噴式環(huán)流反應(yīng)器的傳質(zhì)性能[J].高校化學(xué)工程學(xué)報,1997,11(4):367-371.
[6] 王咪慶,王蓓,錢博群,等.β-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的誘變育種和酶學(xué)特性的研究[J].科技通報,2005,21(3):272-274.
[7] 史仲平,潘豐.發(fā)酵過程解析、控制與檢測技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:31-32.