， ，

(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，浙江 金華 321016)

卡那霉素(kanamycin)是1957年由日本人梅澤濱夫從卡那鏈霉菌(Streptomyceskanamyceticus)發(fā)酵液中提取出的一種氨基糖苷類抗生素[1].卡那霉素在國內(nèi)已有30多年的生產(chǎn)史.長期以來，普遍采用不補(bǔ)料、不控制pH的分批發(fā)酵工藝，高濃度碳、氮源發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、接種后進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天補(bǔ)水1 次，發(fā)酵液流變性差、供氧和傳質(zhì)效果弱.發(fā)酵前期由于大量糖的消耗，pH過低，不利于鏈霉菌生長.發(fā)酵中后期，發(fā)酵液過多的氮源分解以及菌體的早衰導(dǎo)致pH過高，不利于菌體的代謝和卡那霉素的合成，發(fā)酵水平長期徘徊在8 000 U/mL左右.賴濱霞采用間歇補(bǔ)料工藝，效價(jià)達(dá)8 800 U/mL以上[2].補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)已大量應(yīng)用于發(fā)酵過程中[3-5].

針對目前國內(nèi)卡那霉素生產(chǎn)現(xiàn)狀及問題，采用發(fā)酵過程連續(xù)補(bǔ)料工藝，均勻營養(yǎng)、改善供氧和發(fā)酵液流變性，控制pH，提高生產(chǎn)菌的代謝和卡那霉素的合成.新發(fā)酵工藝較大幅度提高了發(fā)酵水平.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

卡那鏈霉菌(Streptomyceskanamyceticus)0708，由浙江金華康恩貝生物制藥有限公司研發(fā)中心提供；枯草芽孢桿菌63501由浙江金華康恩貝生物制藥有限公司質(zhì)量控制部提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉30 g/L，黃豆餅粉20 g/L，葡萄糖6 g/L，玉米粉10 g/L，NaNO31 g/L，CaCO34 g/L，淀粉酶0.03 g/L.pH自然，121 ℃滅菌30 min.

原發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉60 g/L，麥芽糖50 g/L，黃豆餅粉50 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO38 g/L，KH2PO40.2 g/L，CaCO32 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，淀粉酶0.05 g/L，豆油5 g/L，PPE聚醚消泡劑0.1 g/L；pH 6.8～7.2，121 ℃滅菌30 min.

新發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉50 g/L，黃豆餅粉30 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO34 g/L，KH2PO40.2 g/L，CaCO32 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，淀粉酶0.05 g/L，豆油10 g/L，PPE聚醚消泡劑0.1 g/L；pH 6.8～7.2，121 ℃滅菌30 min.

補(bǔ)料培養(yǎng)基：淀粉水解液400 g/L，酵母粉90 g/L，分別進(jìn)行121 ℃滅菌30 min.

1.2 方 法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：用接種環(huán)取卡那鏈霉菌0708在斜面上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)108 h.

種子培養(yǎng)條件：挖取斜面上活化的菌苔，接種到80 mL種子培養(yǎng)液中(750 mL園底三角瓶)，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速220 r/min，28 ℃培養(yǎng)48 h.

發(fā)酵培養(yǎng)條件：按10%接種量，將種子液接種到80 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中(750 mL園底三角瓶)，27 ℃培養(yǎng)144 h，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速230 r/min.

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

50 L發(fā)酵罐裝液量25 L，接種量10%，培養(yǎng)溫度27 ℃，罐壓0.05 MPa, 空氣量15～35 L/min, 攪拌轉(zhuǎn)速300～600 r/min，培養(yǎng)時(shí)間144 h.

補(bǔ)料方法：使用蠕動(dòng)泵流加玉米淀粉水解液，控制發(fā)酵液總糖質(zhì)量濃度(25±5) g/L；發(fā)酵72 h后，當(dāng)溶氧回升時(shí)流加酵母粉溶液(2±0.1) g/(L·d)；用工業(yè)氨水控制發(fā)酵液pH為6.8±0.02.

1.2.3 分析方法

卡那霉素效價(jià)測定方法：管碟法

其他參數(shù)測定方法：

1) 糖測定方法：斐林試劑法.

2) 氨基氮測定方法：甲醛法.

3) 菌體濃度的測定：取發(fā)酵液10 mL，3 500 r/min離心10 min，計(jì)算沉降物占發(fā)酵液的百分比.

2 結(jié)果與分析

2.1 降低發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖質(zhì)量濃度對卡那霉素合成的影響

原發(fā)酵培養(yǎng)基配方中含有玉米淀粉60 g/L、麥芽糖5 g/L，初始糖質(zhì)量濃度高，導(dǎo)致發(fā)酵液流變性差.為降低發(fā)酵液黏度、提高溶氧、節(jié)約成本，研究降低發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖質(zhì)量濃度對卡那霉素合成的影響，結(jié)果見表1.

表1降低發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖質(zhì)量濃度對卡那霉素合成的影響

Table1Effectofreducingfermentationculturedinitialsugarconcentrationonkanamycinsynthesis

序號玉米淀粉/(g·L-1)麥芽糖/(g·L-1)豆油/(g·L-1)卡那霉素效價(jià)/(U·mL-1)對照60505566915050106330250401063623503010652545020106422550101062256500106134

由表1可見：1) 玉米淀粉從60 g/L降到50 g/L，豆油從5 g/L升到10 g/L，效價(jià)提高11.66%；2) 玉米淀粉從60 g/L 降到50 g/L，豆油從5 g/L升到10 g/L，麥芽糖從50 g/L降到30 g/L，效價(jià)比對照提高15%，說明適當(dāng)?shù)亟堤羌佑陀欣诳敲顾睾铣桑?) 維持玉米淀粉50 g/L、豆油10 g/L，只是麥芽糖質(zhì)量濃度從50 g/L 降到30 g/L，效價(jià)提高3%，麥芽糖質(zhì)量濃度繼續(xù)從30 g/L降到0 g/L，效價(jià)下降6%.說明麥芽糖對卡那霉素合成的影響不顯著，出于經(jīng)濟(jì)成本考慮，發(fā)酵培養(yǎng)基初始配方中選擇玉米淀粉50 g/L、豆油10 g/L、麥芽糖0 g/L作為新配方的碳源組合.

2.2 降低發(fā)酵培養(yǎng)基含氮量對卡那霉素合成的影響

原發(fā)酵培養(yǎng)基中含有黃豆餅粉50 g/L，NaNO38 g/L，降低發(fā)酵培養(yǎng)基含碳量有利于卡那霉素合成，為平衡碳氮比，研究降低發(fā)酵培養(yǎng)基含氮量對卡那霉素合成的影響，結(jié)果見表2.

表2降低發(fā)酵培養(yǎng)基含氮量對卡那霉素合成的影響

Table2Effectofreducingfermentationculturednitrogencontentonkanamycinsynthesis

序號蛋白胨/(g·L-1)豆餅粉/(g·L-1)NaNO3/(g·L-1)效價(jià)/(U·mL-1)對照55085898154046225253046485352045206451042149

由表2可見：黃豆餅粉從50 g/L降到30 g/L，NaNO3從8 g/L降到4 g/L，卡那霉素效價(jià)提高10%；黃豆餅粉質(zhì)量濃度繼續(xù)從30 g/L 降到10 g/L，效價(jià)不斷下降.說明發(fā)酵培養(yǎng)基初始配方中黃豆餅粉30 g/L、NaNO34 g/L、蛋白胨5 g/L為最佳氮源組合.

由2.1和2.2的搖瓶發(fā)酵結(jié)果可見：降低初始碳和氮的質(zhì)量濃度，不僅沒有降低產(chǎn)量，卡那霉素的效價(jià)反而提高，說明發(fā)酵培養(yǎng)基可以降低組分濃度.

2.3 連續(xù)補(bǔ)料對卡那霉素合成的影響

抗生素是次級代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的情況下才能合成，但營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏又不能大量持久地合成抗生素.因此連續(xù)低濃度補(bǔ)料可以維持抗生素的長時(shí)間合成.發(fā)酵液pH的變化會影響各種酶活、基質(zhì)利用速率和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌[5].因此控制好發(fā)酵液的pH值有利于卡那霉素合成.

為更好地進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵，對不補(bǔ)料發(fā)酵過程的工藝參數(shù)作圖分析，結(jié)果見圖1.

圖1 不補(bǔ)料工藝的發(fā)酵曲線Fig.1 No feeding process of fermentation

由圖1可見：在發(fā)酵18，42，66，85 h，通過4 次補(bǔ)水稀釋發(fā)酵液，使溶解氧回升；發(fā)酵至96 h，pH高達(dá)7.9，糖和溶氧耗速率下降，卡那霉素效價(jià)增長趨緩，說明營養(yǎng)及環(huán)境條件不適合菌體合成卡那霉素，需要補(bǔ)料及代謝條件的平衡.

應(yīng)用50 L自控發(fā)酵罐，按方法1.2.2發(fā)酵120 h.每6 h取樣，通過斐林試劑法測定發(fā)酵液殘?zhí)呛?通過流加玉米淀粉水解液，控制發(fā)酵液總糖質(zhì)量濃度在(25±5) g/L.通過自動(dòng)流加氨水控制pH為6.8±0.05.發(fā)酵72 h后，依據(jù)維持較高的攝氧率流加酵母粉溶液.連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果見表3.

表3連續(xù)補(bǔ)料對卡那霉素合成的影響

Table3Effectofcontinuousfeedingonkanamycinsynthesis

批號放罐體積/L效價(jià)/(U·mL-1)效價(jià)提高率/%總產(chǎn)量×10-6/U增產(chǎn)率/%對照35．28520—300—02535．911673374194002637．110500233903002735．7113483340535平均36．2111743140535

取表3中025批次發(fā)酵罐的發(fā)酵參數(shù)作圖，結(jié)果見圖2.由表3和圖2可見：采用補(bǔ)料工藝，控制發(fā)酵液pH，卡那霉素效價(jià)平均提高31%，最高達(dá)37%，總產(chǎn)量平均提高35%，最高增產(chǎn)率達(dá)40%.

圖2 補(bǔ)料工藝的發(fā)酵曲線Fig.2 Feeding process of fermentation

2.4 延長發(fā)酵周期對卡那霉素合成的影響

分析圖1,2兩條發(fā)酵曲線發(fā)現(xiàn)：連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵至120 h時(shí)，發(fā)酵液中殘留總糖和氨基氮含量仍較高，比較補(bǔ)料與不補(bǔ)料兩種發(fā)酵過程中卡那霉素的效價(jià)及合成速率，結(jié)果見圖3.

圖3 連續(xù)補(bǔ)料與不補(bǔ)料發(fā)酵過程中卡那霉素效價(jià)與合成速率的變化Fig.3 Variation of kanamycin titer and synthesis rate in continuous and non-fed fermentation

由圖3可見：不補(bǔ)料發(fā)酵工藝卡那霉素合成速率96 h后出現(xiàn)大幅下降，而流加補(bǔ)料工藝發(fā)酵至96～120 h，卡那霉素合成速率仍較高，達(dá)110 U/(mL·h)；發(fā)酵周期延長到144 h，卡那霉素合成速率仍在96 U/(mL·h)，再延長到168 h，卡那霉素發(fā)酵合成速率降低明顯，因此卡那霉素補(bǔ)料工藝的最佳發(fā)酵周期為144 h.

2.5 卡那霉素補(bǔ)料新工藝穩(wěn)定性的研究

采用低濃度碳氮源發(fā)酵培養(yǎng)基，通過流加玉米淀粉水解液和酵母粉溶液，控制pH和溶氧，延長發(fā)酵周期至144 h，平行3 罐驗(yàn)證發(fā)酵新工藝的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4.

表4卡那霉素補(bǔ)料新工藝穩(wěn)定性的驗(yàn)證結(jié)果

Table4Verificationresultsofnewfeedingprocessstabilitykanamycinfermentation

實(shí)驗(yàn)批號效價(jià)/(U·mL-1)放罐體積/L總產(chǎn)量×10-6/U效價(jià)提高率/%增產(chǎn)率/%對照820635．22891001000401397337．05171701790411337637．24981631720421388736．7510169170平均1374537．0508167176

由表4可見：連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵工藝與原不補(bǔ)料工藝比較，卡那霉素效價(jià)最多提高70%，平均提高67%，產(chǎn)量最多提高79%，平均提高76%.平行3 罐驗(yàn)證發(fā)酵新工藝的穩(wěn)定性好，效價(jià)和產(chǎn)量差異均小于5%.

3 結(jié) 論

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