崔榮濤　霍然

[摘要]本文主要探討生物膜在慢性創(chuàng)面中的形成過程、耐藥機制、基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)學等背景。詳細討論了慢性創(chuàng)面愈合過程中生物膜的特點，以及生物膜對創(chuàng)面慢性愈合過程的影響。使用標準敏感性試驗（最小抑菌濃度，簡稱MlCs）來確定慢性創(chuàng)面適宜的治療方案或開發(fā)新的治療方法所面臨的困難，并推薦了針對生物膜的可替代的檢測方法。并描述了當前和未來潛在的用于治療含有生物膜的慢性創(chuàng)面的治療方案，包括毒力減毒、益生菌療法、免疫反應(yīng)抑制和完全清創(chuàng)結(jié)合抗菌敷料的應(yīng)用等。

[關(guān)鍵詞]密度感應(yīng)；抗生素耐藥性；胞外多糖；炎癥反應(yīng)；創(chuàng)面愈合；最小抑菌濃度

[中圖分類號]R318 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）02-0005-06

慢性創(chuàng)面是指機體損傷且并發(fā)有抑制創(chuàng)面愈合的疾病時，導致創(chuàng)面愈合困難，其愈合過程大于8周，一般將慢性創(chuàng)面劃分為靜脈性潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、壓力性潰瘍5類常見類型，其他還有由腫瘤和結(jié)締組織疾病麻風等引起的創(chuàng)面。隨著全球肥胖人數(shù)增加和人口老齡化的進展，慢性創(chuàng)面人群不斷增加，導致醫(yī)療費用急劇上升，認清慢性創(chuàng)面的愈合機制，促進創(chuàng)面愈合是目前創(chuàng)面治療研究的熱點與難點。臨床上形成慢性創(chuàng)面的病因復雜，影響創(chuàng)面愈合的因素也是錯綜復雜的，創(chuàng)面感染是其最主要的影響因素。有研究指出，生物膜的形成是導致或加重慢性感染的主要原因，自然界中99%的細菌是以生物膜的形式存在，約65%的人類感染與生物膜有關(guān)，更有學者認為超過80%的人類感染中有生物膜形成。因此，了解生物膜的形成及對創(chuàng)面愈合的影響機制，防止生物膜對創(chuàng)面愈合的影響，對于提高慢性創(chuàng)面的治愈率有著重要作用。

1978年美國Costerton JW基于對呼吸機導管污染的細菌群體所引發(fā)相關(guān)性肺炎的研究，提出了Biofilm（細菌生物膜或微生物生物膜，國內(nèi)也有的譯為生物膜）這一專用名詞，得到了國際學術(shù)界的認可。Biofilm是微生物生長過程中附著于物體表面而形成的由微生物及其分泌的聚合物所組成的有三維結(jié)構(gòu)的菌細胞群體。大多數(shù)微生物，如細菌、真菌、支原體等都可以形成生物膜，微生物形成生物膜后，其生物學特性可發(fā)生改變，如營養(yǎng)代謝、生長率等，其中主要表現(xiàn)為耐藥性的改變。過去幾十年的研究表明，根據(jù)在貼壁生物中與生命相關(guān)的營養(yǎng)和保護性作用特性，自然環(huán)境中所有已知微生物中有98%以上都是以群體的方式而存在的。細菌附著在非生物或生物表面，它們會產(chǎn)生復雜的含有多聚體的多糖、蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、褐藻酸和腐質(zhì)等胞外聚合體，這有助于保持微生物間的連接，并使細菌細胞彼此交聯(lián)，這是細菌在生長過程中為適應(yīng)環(huán)境而形成的一種特殊的生存方式，也是與浮游細胞相對應(yīng)的存在形式。

1生物膜的形成過程

細菌形成生物被膜是一個動態(tài)的過程，主要可分為以下四個階段：

1.1細菌可逆性粘附的定殖階段：當浮游細菌與惰性物體表面或活性實體的表面接觸后，浮游細菌會粘附到物體表面，啟動在物體表面形成生物膜。在這個階段，單個附著細胞僅由少量胞外聚合物包裹，還未進入生物膜的形成過程，很多菌體還可重新進入浮游狀態(tài)，因此這時細菌的粘附是可逆的。

1.2細菌不可逆性粘附的集聚階段：細菌在經(jīng)過初始定殖粘附后，一些特定基因的表達開始調(diào)整，與形成生物膜相關(guān)的基因被激活，細菌在生長繁殖的同時分泌大量胞外聚合物粘結(jié)細菌。在這個階段，細菌對物體表面的粘附更為牢固，是不可逆的。

1.3生物膜的成熟階段：細菌與物體表面經(jīng)過不可逆的粘附階段后，生物膜的形成逐漸進入成熟期。成熟的生物膜形成高度有組織的結(jié)構(gòu)，由類似蘑菇狀或堆狀的微菌落組成，在這些微菌落之間圍繞著大量通道，可以運送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物等。因此，成熟的生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)被比喻為原始的循環(huán)系統(tǒng)。

1.4生物膜中細菌的脫落與再定殖階段：成熟的生物膜通過蔓延、部分脫落或釋放出浮游細菌等進行擴展，脫落或釋放出來的細菌重新變?yōu)楦∮尉?，它們又可以在物體表面形成新的生物膜。

2生物膜的密度感應(yīng)

密度感應(yīng)是細菌彼此之間傳遞信號的一種特殊機制。細菌能產(chǎn)生一種自體誘導物（Autoinducer，AI）的信號分子，并根據(jù)其濃度來調(diào)控外周環(huán)境中菌種內(nèi)和菌種間的數(shù)量變化。隨著細菌細胞密度的增加，AI信號分子濃度也隨之增加，當AI積累到一定閾值時，可以啟動菌體中相關(guān)基因表達或改變某些基因特性以適應(yīng)外界生存環(huán)境，這一現(xiàn)象被稱為密度感應(yīng)（Quorum sensing，QS），是生物膜形成和生物膜特異性表達的關(guān)鍵過程。

目前，研究最深入的是由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（Acyl-homoserine lactones，AHLs），革蘭氏陽性菌通常表現(xiàn)為產(chǎn)生小肽以及稱為AI-2的一類分子，其結(jié)構(gòu)在很大程度上是未知的。這些AI都是在細菌細胞中以基礎(chǔ)速率產(chǎn)生的小分子。這些AI中的大多數(shù)可在細菌膜上自由擴散，在這種情況下，它們的細胞內(nèi)濃度接近于周圍環(huán)境中的濃度。隨著局部區(qū)域（微菌落）內(nèi)細菌數(shù)量的增加，AI的有效濃度升高。一旦AI的細胞內(nèi)濃度達到臨界水平，AI誘導基因表達改變，這將導致生物膜性質(zhì)變化。

密度感應(yīng)最常為研究的兩種細菌種類為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，這兩種細菌通常與慢性創(chuàng)面相關(guān)。與其他革蘭氏陽性菌一樣，金黃色葡萄球菌利用肽密度感應(yīng)系統(tǒng)作為基于多肽的密度感應(yīng)模型。在此菌群中，密度感應(yīng)是由agr基因編碼的自體誘導肽（Autoinducingpeptides，AIPs）介導的。同一基因也控制了一些毒性因子，其中包括生物膜的形成。銅綠假單胞菌的密度感應(yīng)機制也得到了廣泛研究，結(jié)果顯示慢性創(chuàng)面中許多毒性因子的定植處于密度感應(yīng)途徑的控制下，包括分泌的毒性因子（例如蛋白酶），細胞附著因子（例如脂多糖）和生物膜的形成。密度感應(yīng)在生物膜的發(fā)育早期就有影響，密度感應(yīng)突變體不能形成結(jié)構(gòu)正常的生物膜。

有關(guān)密度感應(yīng)參與體內(nèi)生物膜生成過程的其他證據(jù)，包括銅綠假單胞菌定植的囊性纖維化患者中分離出的明顯濃度的假單胞菌AIs。然而，從囊性纖維化患者的痰中也分離出許多密度感應(yīng)突變體。這表明感應(yīng)密度必須有基于菌群總體的精確消耗，也就是說并不是菌群中所有成員都需要一個功能性的密度感應(yīng)系統(tǒng)。最近的研究結(jié)果表明，在更高的細胞密度下，密度感應(yīng)控制下產(chǎn)生的細胞外因子更有效，并為群體提供益處。同時表明密度感應(yīng)分子可直接影響宿主細胞，改變宿主的細胞功能，包括抑制淋巴細胞增殖等活動。

3生物膜的抵抗力

生物膜對人類生活的許多方面都是非常有益的，包括預防大腸的移植抵抗，有機化合物和環(huán)境污染物的降解及全球養(yǎng)分循環(huán)。然而，這些代謝整合的多細胞群體在工業(yè)和臨床環(huán)境中在很大程度上被認為是會帶來麻煩的，主要是因為生物膜非常難以被抗微生物劑和宿主的免疫應(yīng)答消除。一般認為生物膜對抗菌治療的敏感性要低于浮游細菌，可降低100～1000倍。

經(jīng)過眾多體內(nèi)和體外研究，結(jié)果表明外聚物可以保護慢性創(chuàng)面生物膜免受創(chuàng)面愈合炎癥反應(yīng)的影響，這一炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵步驟。有學者建議使用外聚物來阻斷補體的活化，抑制淋巴組織增生反應(yīng)，并阻止吞噬細胞檢測細菌細胞壁上的調(diào)理素。研究結(jié)果還顯示，外聚合物限制了白細胞穿透生物膜的能力，阻礙其通過生物膜的運動，減弱其脫粒和產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的能力，并預防細菌的吞噬。將細菌生物膜暴露于亞抑制性抗生素濃度或錯誤的抗生素中，可能會誘發(fā)粘液表型，從而產(chǎn)生更厚的附加基質(zhì)成分的生物膜。

眾所周知，生物膜相關(guān)感染難以根除，并且在過去的30年中一直是科學研究的主題。

生物膜相關(guān)感染包括用于移植的醫(yī)療設(shè)備的細菌定植，如中心靜脈導管、關(guān)節(jié)假體、導尿管、起搏器和機械心臟瓣膜、齲齒、肺囊性纖維化患者的肺部感染及慢性創(chuàng)面等。研究表明，大多數(shù)人類感染（約60%～80%）是生物膜相關(guān)的。生物膜相關(guān)的皮膚疾病包括燒傷、壓瘡、手術(shù)部位感染和糖尿病足潰瘍等，美國每年發(fā)病率約為196萬人，約有26萬人死亡，且每年的直接成本約為180億美元。

經(jīng)過數(shù)年研究，眾學者提出了各種機制來解釋生物膜對于積極治療的耐受性。理論包括：生物膜聯(lián)盟的生理異質(zhì)性；殘留細胞的存在使得生物膜能夠在治療后重新生長；生物膜相關(guān)細菌代謝率低，影響常用抗生素的作用機制，外排泵過度表達開放閱讀框；由外聚物引起的限制藥物擴散，耐藥基因的優(yōu)勢可以很容易地轉(zhuǎn)移至生物膜內(nèi)的其他生物。沒有一個單一機制可以充分解釋這些細菌群體長期的慢性化程度，考慮可能涉及到這些機制的組合。

4生物膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)

最初，生物膜被認為是微生物無組織的聚集體。這一觀點得到了來自不同環(huán)境的生物膜其結(jié)構(gòu)相似的證據(jù)的支持。有證據(jù)表明，遺傳和環(huán)境因素是形成生物膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)的原因。隨著對氧化鋅納米線和蜂巢的探索，有明確的證據(jù)表明生物膜的結(jié)構(gòu)比以前想象的更有組織性。

最近一項研究也表明，枯草芽孢桿菌和恥垢分枝桿菌通過產(chǎn)生方解石礦物質(zhì)來維持生物膜的結(jié)構(gòu)。這一礦物質(zhì)的產(chǎn)生是由二氧化碳水平的升高而引起的，由菌落內(nèi)的固有堿性環(huán)境促進產(chǎn)生，并由細胞外基質(zhì)成分引導。這些礦物支架可提供物理穩(wěn)定性，抵抗環(huán)境污染（包括抗菌劑），提高生物膜的整體適應(yīng)性（包括有毒二氧化碳的沉淀），可能在細菌多細胞交聯(lián)中發(fā)揮重要作用。

研究表明，銅綠假單胞菌對抗生素的敏感性隨著粘度下降而增加。在高粘度[15%聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）]的慶大霉素存在下生長的銅綠假單胞菌具有比在培養(yǎng)基中生長的細胞高6倍（P=0.01）的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentrations，MICS）。類似地，在高粘度（12.5%PVP）下，該生物體對哌拉西林的應(yīng)答低于低粘度時的11倍（P=0.0001）。當銅綠假單胞菌在高粘度下生長一段時間后，通過稀釋（1：100）然后孵育3h來改變粘性，MICS值恢復到與在水中接近。此外，銅綠假單胞菌和白色念珠菌兩者的生長速率，特別是最終產(chǎn)生的細胞數(shù)也隨著生長培養(yǎng)基粘度的增加而增加。銅綠假單胞菌和白色念珠菌分別產(chǎn)生3倍和10倍以上的細胞，粘度高于對照組。因此，這些生物體在高粘度環(huán)境中表現(xiàn)得像生物膜一樣，并且隨著粘度降低而像浮游生物一樣，這表明降低的代謝活性與耐受性沒有直接關(guān)系，并且生物膜表型可以在不與基質(zhì)結(jié)合的情況下表達，這一研究可能對創(chuàng)面護理有深遠影響。高度滲出性創(chuàng)面通常容易被感染并出現(xiàn)重度炎癥。在中度至高度滲出性創(chuàng)面中，水的蒸發(fā)通過蛋白質(zhì)濃度的增加從而導致殘余流體的粘度增加。定植在這種較高粘度滲出物中的生物體可能能夠表達降低的抗生素敏感性的生物膜特征，使其難以控制。

5慢性創(chuàng)面中的生物膜

目前，經(jīng)過大量動物實驗及臨床研究，在慢性創(chuàng)面中已經(jīng)明確鑒別出了細菌生物膜。細菌生物膜存在于創(chuàng)面中的早期證據(jù)主要來源于動物實驗造模中的慢性創(chuàng)面，隨后在臨床創(chuàng)面中得到了證實。慢性創(chuàng)面的細菌定植存在相當大的異質(zhì)性，當致病細菌共生后就會成為主要的微生物群落。

不同創(chuàng)面間細菌的類型和相對數(shù)量都存在明顯不同。一項研究顯示每個創(chuàng)面有多達17種不同細菌（包括需氧和厭氧菌）。有學者研究表明，每個創(chuàng)面的微生物有12～20種不同菌種是常見的，有60種不同類型的菌種也并不少見。許多研究表明，完整皮膚的微生物種群越豐富，對感染傳播的保護作用越大。然而，將某些致病物種（特別是金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌）引入環(huán)境可以引起未受傷的皮膚共棲菌群被替代，從而導致向感染狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。這表明慢性創(chuàng)面護理中益生菌療法可能將微生物生態(tài)恢復到健康狀態(tài)。有學者成功使用正常糞便移植治療由艱難梭菌過度生長引起的嚴重的、反復發(fā)作的胃腸炎患者。

生物膜深部的缺氧促進了厭氧菌在慢性創(chuàng)面中的增殖。因此，不僅要關(guān)注創(chuàng)面的細菌負荷量，而且要重點關(guān)注創(chuàng)面內(nèi)存在的菌群及其相互作用，包括探索菌群間是否共存相互促進增殖或存在競爭機制。有研究發(fā)現(xiàn)多重疊模式的共聚菌群，可表現(xiàn)出協(xié)同作用的能力，進而導致生物膜慢性創(chuàng)面感染，被稱為“功能等價群體”。

在生物膜深部，存在與一般的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的生長速率降低的微生物，可以保護細菌免受pH變化、化學試劑濃度、滲透壓以及免受活性細菌生長所需要的化學物質(zhì)的影響。此外，生物膜包含許多濃度梯度，產(chǎn)生對抗生素和防腐劑有負面影響的微環(huán)境，而在某些情況下，促進特定微生物物種的生長。這些微環(huán)境可以包括有氧和厭氧微環(huán)境。盡管一些作者認為大多數(shù)生物膜細胞可以被抗生素消滅，但是在治療后的慢性創(chuàng)面中會出現(xiàn)生物膜的快速再生。這表明在這些生物膜內(nèi)存在存留細胞。存留細胞估計占生物膜的0.1%～10%，也存在于浮游生物培養(yǎng)基中。它們是通過表型變化表現(xiàn)出抗生素耐受性的表型變體，例如代謝靜止和/或關(guān)閉抗生素靶標。

抗菌素有效性的缺乏可能與抗菌素滲入生物膜的減少或不完全有關(guān)。外聚物的凈負電荷可以隔絕帶正電荷的化合物和/或排斥帶負電荷的化合物，防止與生物膜內(nèi)的微生物接觸。一些有機體也釋放分泌抗生素分子?？傮w來說，這使得治療慢性生物膜相關(guān)感染比治療急性浮游感染更具挑戰(zhàn)性。

目前可用的許多治療方法都是為了治療急性感染而設(shè)計的，與慢性感染不同，它們很快就會出現(xiàn)并在很短的時間內(nèi)失去效用。浮游細菌通常對抗菌素有應(yīng)答反應(yīng)，容易被健康的免疫系統(tǒng)消滅。相反，與急性創(chuàng)面相比，慢性創(chuàng)面通常具有頑固性和過度的炎癥反應(yīng)，并且不易受抗生素的影響。

成熟的生物膜一般10h內(nèi)就會在慢性創(chuàng)面中形成，并在創(chuàng)面開放時無限期地持續(xù)存在。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)，雖然慢性創(chuàng)面的清創(chuàng)手術(shù)可有效地從創(chuàng)面床中清除掉生物膜群落，生物膜在初步清創(chuàng)2d后又開始重新崛起，并在清創(chuàng)3d后成熟的生物膜中發(fā)現(xiàn)大量的細菌。這表明在清創(chuàng)后有一個時間窗，在這期間浮游細菌重新定殖創(chuàng)面，容易治療并可高效殺死細菌，并防止生物膜群落的改變。

在慢性創(chuàng)面中形成的生物膜不同于其他感染類型中觀察到的生物膜。事實上，在許多慢性創(chuàng)面中，真正的生物膜的存在可能難以被證實。然而，通?？稍趧?chuàng)面環(huán)境內(nèi)很明顯的形成微菌落（即相對較少數(shù)量的非常接近的細胞）。鑒于某些種類的細菌，如銅綠假單胞菌在小菌落階段顯示出可提高AI水平的作用，并且一些AI具有直接影響人類細胞的能力，這些存在的微菌落可以促進創(chuàng)面的慢性化。例如，如果小菌落足夠大以防止它們被吞噬細胞吞噬，吞噬作用可能引起一些吞噬細胞的脫?；＿@將導致過度的免疫炎性反應(yīng)，可能將會改變創(chuàng)面中各種因素的平衡，例如抑制正常創(chuàng)面閉合的基質(zhì)金屬蛋白酶，當這種免疫反應(yīng)被減弱時，創(chuàng)面可以迅速的正常愈合。

6展望

隨著研究的不斷進展，越來越多的細菌對抗生素具有遺傳抵抗性。即使是細菌對抗生素不具有遺傳抵抗性，其本身的生長模式也可耐受抗生素。細菌耐藥性的問題和解決這一問題的新方法的探索已迫在眉睫。即便如此，也很少有制藥公司探索新的抗生素治療藥物，其中一部分原因是研制新藥困難，且發(fā)現(xiàn)在不損害患者健康前提下可以對患者施以足夠高的藥物濃度來抑制細菌生長。再加上短期抗生素治療往往使研究新藥這一領(lǐng)域在經(jīng)濟上沒有吸引力。因此，毒力衰減方法被眾多研究者所青睞，涉及到治療藥物實際上不會殺死細菌，而是這些化合物會干擾細菌產(chǎn)生毒力因子的能力，例如在生長期間產(chǎn)生的因子作為促進對現(xiàn)有藥物的對抗性的生物膜。這種方法是特別有吸引力的，其理論上是對細菌群落施加較少的選擇性壓力，從而減緩抗生素耐藥機制的發(fā)展。

最近在這一領(lǐng)域的研究重點是銅綠假單胞菌，并提供了大量的數(shù)據(jù)資料。在研究抑制密度感應(yīng)的化合物的抗性發(fā)展的實驗中，細菌可以通過促進高效外排泵來產(chǎn)生對這些分子的抗性。因此，維持細菌群體在一定可控水平下，同時阻止過度免疫反應(yīng)可能是使宿主消除感染所必需的。目前，在慢性創(chuàng)面中，這樣的治療策略可能涉及使用一些抗菌敷料與完全清創(chuàng)術(shù)等技術(shù)相結(jié)合的方法。

目前正在研究的一些潛在的抗生物膜治療方法是基于生物膜最終作為存活細胞離開生物膜并被分散而解體的事實，尤其是當生物生存資源變得有限且細胞廢物產(chǎn)物或其他毒素不斷積累時。生物膜解體通常涉及破壞基質(zhì)成分的誘導酶，從而釋放生物膜相關(guān)細胞；因此，酶處理可能是生物膜根除的一種方法。與此同時，研制出的重組噬菌體可以攻擊生物膜細胞并產(chǎn)生基質(zhì)降解酶。此外，鑒于生物膜形成需要細胞信號傳導，一些研究人員認為，干擾這些信號通路的小分子可能對生物膜根除有用。小分子也可以通過至少四種不同的機制自然觸發(fā)和介導生物膜的解體，包括：信號和線索、細胞包膜修飾分子、抗基質(zhì)分子、促進細胞死亡的分子。

應(yīng)用這些潛在的抗生物膜方法有許多未知性，包括生物膜解體活化所需的信號分子可以是物種，甚至是應(yīng)力依賴性的，而且一些密度感應(yīng)途徑可能僅在生物膜形成初始中起重要作用，因此密度感應(yīng)對于早期建立的生物膜的解體并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，許多小分子特別是抗基質(zhì)分子在不同條件下具有雙重作用，可引發(fā)生物膜的形成、成熟、維持，甚至導致生物膜的解體。

7總結(jié)

生物膜已經(jīng)成為一個日益重要的研究課題，創(chuàng)面一旦形成了生物膜，細菌就具有極強的耐藥性，生物膜導致的慢性創(chuàng)面感染可持續(xù)存在，比由浮游細菌引起的感染造成的損傷和炎癥反應(yīng)更為嚴重。在生物膜狀態(tài)下極易導致難治性慢性感染，使創(chuàng)面遷延不愈，愈合率降低，愈合時間延長，增加患者痛苦及醫(yī)療費用。因此，使用適宜的抗菌劑來治療這種生物膜感染導致的慢性創(chuàng)面感染是至關(guān)重要的。隨著微生物學的發(fā)展，使人們進一步認識了生物膜在創(chuàng)面中的形成過程和影響機制，對指導預防和診療起到極其重要的作用。當然，如今對于生物膜的研究還處于探索階段，隨著相關(guān)研究廣泛而深入地開展，人們對生物膜引起的慢性反復性感染及其耐藥機制也會有更加深入和全面透徹的認識。不同細菌在不同條件下形成的生物膜結(jié)構(gòu)各異，而各種生物膜清除劑的作用方式也不盡相同，導致其適用范圍不同。目前雖然對控制和清除生物膜有了一定的探索研究，并且對生物膜性質(zhì)及生物膜細菌的生理和分子特征有了很好地了解，但對于如何抑制和減少生物膜的生成，根除已經(jīng)生成的生物膜，促進創(chuàng)面愈合，獲得最佳的生物膜清除手段還有待于不斷深入探索。

[收稿日期]2018-01-19 [修回日期]2018-01-30

編輯/朱婉蓉