利用農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)青霉菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶

訾　慧， 白洪志， 王　惠， 韓曉日， 劉　寧， 黃玉茜， 韓　梅， 楊勁峰

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866； 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

木質(zhì)纖維素是所有植物的基石，并普遍存在于地球的大部分地區(qū)，木質(zhì)纖維素的化學(xué)組成使其成為巨大的生物技術(shù)價(jià)值的基材。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)木質(zhì)纖維素的構(gòu)架能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[1]。利用生物質(zhì)過(guò)剩、農(nóng)業(yè)廢棄物和農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)廢渣生產(chǎn)新能源的概念，生物發(fā)酵得到了越來(lái)越多的關(guān)注。因?yàn)殡S著石化燃料由短缺變枯竭，能源是人類(lèi)面臨的共同問(wèn)題。尋找新的能量來(lái)源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類(lèi)的生存[2]。

固態(tài)發(fā)酵作為纖維素生物轉(zhuǎn)化的手段，在過(guò)去的幾十年中，利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)大量化學(xué)品和酶有逐漸增加的趨勢(shì)[3]。固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵之間的直接比較是非常困難的，主要由于這2種技術(shù)使用了不同的微生物濃度，但固態(tài)發(fā)酵中的微生物具有更高的代謝能力，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮咏匀坏沫h(huán)境下增殖。這種方法能通過(guò)比液態(tài)發(fā)酵能源需求少、發(fā)酵罐體積小、污染物排放少等特點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生更穩(wěn)定的產(chǎn)品[4]。

微生物所產(chǎn)生的纖維素酶系是一個(gè)多組分酶系，通常將纖維素分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[5]。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中所用的纖維素酶是主要由真菌分泌的胞外酶。所述酶可以有效地降解木質(zhì)纖維素底物的纖維素鏈，以產(chǎn)生更小的糖單元如纖維二糖和葡萄糖[6]。纖維素酶在食品、釀造行業(yè)、農(nóng)副產(chǎn)品、深加工飼料、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)和化工等領(lǐng)域有非常廣闊的應(yīng)用前景和應(yīng)用潛力。

1　材料和方法

1.1　篩選培養(yǎng)基

1.1.1富集培養(yǎng)基將粉碎的秸稈裝入150 mL三角瓶中，每瓶5 g，加7.5 mL無(wú)機(jī)鹽溶液，封口膜封口，121 ℃滅菌1.5 h。

無(wú)機(jī)鹽溶液：(NH4)2SO43.000 0 g、FeSO4·7H2O 0.005 0 g、KH2PO41.000 0 g、MnSO4·H2O 0.001 6 g、MgSO4·7H2O 0.500 0 g、ZnSO4·7H2O 0.001 7 g、CaCl2·H2O 0.114 0 g、CoCl20.002 0 g、NaCl 0.100 0 g、蒸餾水1.000 0 L。

1.1.2綜纖維素培養(yǎng)基次氯酸鈉脫除木質(zhì)素法：稱取一定量的原料，加入pH值為4.2～4.7的次氯酸鈉溶液，在75 ℃下處理2 h，然后用清水洗至中性，烘干得到綜纖維素。

加濃的Mandels鹽溶液：KH2PO43.0 g、(NH4)2SO42.0 g、尿素0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.5 g、FeSO4·7H2O 1.5 mg、MnSO4·H2O 2.5 mg、ZnSO42.0 mg、CoCl 3.0 mg，pH值約5.5。

1.1.3濾紙條培養(yǎng)基在加濃的Mandels鹽溶液中添加 20 g 瓊脂，倒好平板后鋪1片濾紙片在培養(yǎng)基上。

濾紙?zhí)幚恚菏褂们皩⑵溆?%醋酸溶液浸泡24 h以除去淀粉，用碘檢驗(yàn)，再用2% NaHCO3溶液洗至中性曬干。

1.1.4羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基CMC-Na 15.0 g、NH4NO31.0 g、酵母粉1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g、ddH2O 1.0 L、瓊脂20.0 g，pH值自然。

1.1.5微晶纖維素培養(yǎng)基下層：在加濃的Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽溶液中加入2%瓊脂。上層：在加濃的Mandels鹽溶液中加入1.5%球磨微晶纖維素粉(微晶纖維素用2 mm玻璃珠 200 r/min 振蕩24 h)、2%瓊脂。于9 cm平皿中倒入下層培養(yǎng)基約15 mL，待凝固后加入上層培養(yǎng)基，使其成為均勻的薄層備用。

1.1.6馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200 g或葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 L，pH值自然。

馬鈴薯去皮，切成塊，煮沸30 min，然后用紗布過(guò)濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.1.7復(fù)篩培養(yǎng)基稻草粉2.30%、蛋白胨0.30%、硫酸銨 0.20%、酵母膏0.05%、KH2PO40.40%、CaCl2·2H2O 0.03%、MgSO4·7H2O 0.03%。

試驗(yàn)所有化學(xué)品和試劑均為分析純。

1.2　菌種的分離和純化

土壤樣品采自長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)和柴垛附近。把樣品裝到無(wú)菌采樣袋中，標(biāo)記并保存在4 ℃冰箱中，做進(jìn)一步的分析工作。將土壤樣品在富集培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)7 d，并連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，1式3份[7]。用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離菌株，把所有分離的菌株接種到PDA斜面上后，在4 ℃下保存。然后，用綜纖維培養(yǎng)基[8]、濾紙條培養(yǎng)基[9]、CMC-Na培養(yǎng)基[10]和微晶纖維素培養(yǎng)基[11]的方法對(duì)分離的菌株進(jìn)行篩選。

為了使透明水解圈清晰可見(jiàn)，筆者所在實(shí)驗(yàn)室采用雙板法，先在培養(yǎng)皿中鋪上1層固體透明的基本瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后再鋪上1層薄薄的含綜纖維素的培養(yǎng)基，既保證了培養(yǎng)基的篩選選擇性，又不至于太難篩選到需要的菌株。將分離得到的單菌落接種于CMC-Na平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d后取出，倒入適量配制好的1 mg/mL剛果紅溶液，放置30 min后，用蒸餾水溫和漂洗，最后倒入適量1 mol/L NaCl溶液，放置30 min。以透明圈直徑和菌落直徑的比值為標(biāo)準(zhǔn)，初步判斷各個(gè)菌落產(chǎn)纖維素酶的能力。

1.3　分子鑒定分離的真菌

形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特征的鑒定，采用點(diǎn)種法在PDA培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)。ITS序列鑒定：以提取所述菌株的基因組總DNA為底物，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)為正向引物、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)為反向引物對(duì)菌株進(jìn)行18S rDNA擴(kuò)增。PCR在Taq酶說(shuō)明書(shū)[天根生化科技(北京)有限公司]的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。將該P(yáng)CR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，選取同源性較高的模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，借助MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[12]。

1.4　酶活性的測(cè)定

對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行酶活性測(cè)定。向培養(yǎng)基中加入一定體積的蒸餾水，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩浸提1 h，濾紙過(guò)濾，10 000 r/min離心15 min。將澄清的上清液用作粗酶液[13]。

羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，簡(jiǎn)稱CMCase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，簡(jiǎn)稱β-Gase)活性的測(cè)定：在試管中加入 1 mL 底物[1% CMC-Na或0.5%水楊素檸檬酸緩沖溶液(pH值4.8)]及1 mL粗酶液，50 ℃保溫 30 min，取出，加入 2 mL DNS試劑，煮沸5 min，冷卻后稀釋5倍，搖勻，530 nm處測(cè)定吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量折算成酶活性單位(U/g)。

濾紙酶(filter paper lyase，簡(jiǎn)稱FPase)活性測(cè)定：于試管中加入1.0 mL檸檬酸緩沖液(pH值4.8)，Whatman No.1濾紙片[1 cm×6 cm，(50±1) mg]1片，以及1 mL粗酶液，50 ℃ 保溫 60 min，取出，加入2 mL DNS試劑，其他步驟同CMC酶活性測(cè)定。

酶活性單位定義：在纖維素酶最適反應(yīng)條件下，1 min水解纖維素底物產(chǎn)生1 μg還原糖的量定義為1個(gè)酶活性單位，用U/g表示。

1.5　生產(chǎn)纖維素酶工藝參數(shù)的優(yōu)化

對(duì)各種工藝參數(shù)，如發(fā)酵時(shí)間(24～168 h)、培養(yǎng)基初始pH值(3～8)、培養(yǎng)溫度(20～45 ℃)、接種量(0.5～3.0 mL/3 g 底物)、料水體積比(1.0 ∶1.0～1.0 ∶3.5)、底物粒徑、不同氮源(硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏)等[14]進(jìn)行優(yōu)化。

2　結(jié)果與分析

2.1　菌株的鑒定

大多數(shù)真菌一直使用傳統(tǒng)的分類(lèi)學(xué)和肉眼觀察進(jìn)行鑒定[15]。從土壤中分離出1株產(chǎn)纖維素酶菌株，命名為ZH1，將該菌株在PDA培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)7 d進(jìn)行形態(tài)的鑒定。該菌株的營(yíng)養(yǎng)體為綠色的菌絲體，菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜，分生孢子梗頂端呈特殊的對(duì)稱或不對(duì)稱的掃帚狀。這些結(jié)果表明，這種生產(chǎn)纖維素酶的真菌是青霉菌。由于18S rDNA序列被廣泛使用，筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)這種纖維素酶生產(chǎn)菌株的18S rDNA基因進(jìn)行測(cè)序[16]。該菌株的18S rDNA基因序列為551 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，由圖1可知，ITS序列與ZH1相似性最高的菌株均屬于青霉菌屬(Penicillium)，該菌株與Penicilliumochrochloronstrain IHB F 2914的18S rDNA序列有較高的同源性。因此，鑒定菌株為赭綠青霉(Penicilliumochrochloron)。

2.2　時(shí)間對(duì)菌株ZH1生產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖2可知，在72 h有最大的濾紙酶(FPase)活性，在 48 h 時(shí)有最大的CMCase、β-Gase活性。Qaisar等認(rèn)為，細(xì)胞生長(zhǎng)能增加抑制酶的生產(chǎn)[17]。因此，生產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d，進(jìn)一步培養(yǎng)會(huì)增加菌種培育期導(dǎo)致酶活性降低。酶活性的降低可能是由pH值的變化或在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞代謝導(dǎo)致酶的變性所致[18]。

2.3　初始pH值對(duì)菌株ZH1生產(chǎn)纖維素酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)酶有顯著的影響，每種微生物的生長(zhǎng)均具有最佳的pH值范圍。絲狀真菌在pH值為3～8的范圍內(nèi)能夠良好地生長(zhǎng)，極端pH值(過(guò)高或過(guò)低)可能會(huì)導(dǎo)致微生物死亡[19]。由圖3可知，在培養(yǎng)基初始pH值為4時(shí)有最大的FPase活性和β-Gase活性，CMCase活性最大時(shí)pH值為5。這項(xiàng)研究結(jié)果與Irfan等利用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基纖維素酶最佳培養(yǎng)基初始pH值為5的報(bào)道[20]相一致。有報(bào)道顯示，生產(chǎn)β-Gase的最佳pH值為5.0[21]或5.5[22]。

2.4　溫度對(duì)菌株ZH1生產(chǎn)纖維素酶的影響

培養(yǎng)溫度是影響糖化發(fā)酵生產(chǎn)酶的一個(gè)重要因素[6]。由圖4可知，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，F(xiàn)Pase、CMCase、β-Gase都有最大的活性。在發(fā)酵過(guò)程中不同的真菌生產(chǎn)纖維素酶的最佳溫度范圍為25～45 ℃[18，23]。

2.5　接種量對(duì)生產(chǎn)纖維素酶的影響

使用最佳料水體積比，接種量分別調(diào)節(jié)至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/3 g以研究其對(duì)生產(chǎn)纖維素酶的影響。由圖5可知，接種量為0.5 mL/3 g時(shí)有最大的FPase、CMCase、β-Gase 活性。酶產(chǎn)量隨著接種量的增加而下降。因此，接種量是生產(chǎn)纖維素酶的一個(gè)重要因素。Huang等報(bào)道，產(chǎn)酶情況與菌株的生長(zhǎng)相關(guān)，接種量影響纖維素酶的活性[24]。Raza等通過(guò)用麥麩作為底物接種2 mL/10 g黑曲霉和米曲霉的孢子懸浮液，獲得最高的β-Gase活性[22]。

2.6　料水體積比對(duì)生產(chǎn)纖維素酶的影響

對(duì)于固態(tài)發(fā)酵，真菌喜歡生活在適當(dāng)潮濕的環(huán)境，有利于它們的成長(zhǎng)和酶的生產(chǎn)。本試驗(yàn)以稻草為主要底物，研究不同料水體積比對(duì)生產(chǎn)纖維酶的影響。由圖6可知，1.0 ∶3.0的料水體積比適合生產(chǎn)CMCase、FPase，1.0 ∶2.5的料水體積比適合生產(chǎn)β-Gase。在固態(tài)發(fā)酵中過(guò)多或過(guò)少的水量都會(huì)影響纖維素酶的生產(chǎn)，維護(hù)適當(dāng)?shù)乃质欠浅Ｖ匾?，因?yàn)樗鼤?huì)影響底物孔隙大小最終影響氧的移動(dòng)[21]。Mehboob等報(bào)道，白腐真菌最佳生產(chǎn)纖維素酶的料水體積比為1 ∶3[25]。綠色木霉使用麥草作為底物生產(chǎn)CMC酶的最優(yōu)含水量為40%[20]。

2.7　稻草粉底物粒徑對(duì)生產(chǎn)纖維素酶的影響

底物的粒徑(比表面積)對(duì)微生物生長(zhǎng)非常重要，因?yàn)樗谔腔l(fā)酵過(guò)程中傳遞熱與能量[26]。在本試驗(yàn)中使用不同粒徑的稻草粉，研究其對(duì)生產(chǎn)纖維素的影響。由圖7可知，當(dāng)?shù)孜锪綖?.250～0.425 mm 時(shí)，比其他尺寸生產(chǎn)的酶活性高。小的粒子激發(fā)真菌的生長(zhǎng)，因?yàn)樗峁┝溯^大的表面積，有利于微生物的營(yíng)養(yǎng)攝取，但會(huì)降低傳熱及氧氣與二氧化碳的交換。較大底物粒徑(0.850 mm)時(shí)，真菌生長(zhǎng)被限制，由于表面面積小導(dǎo)致酶生產(chǎn)的降低[27]。這表明稻草粉粒度對(duì)菌株生產(chǎn)纖維素酶具有明顯影響。

2.8　氮源對(duì)生產(chǎn)纖維素酶的影響

氮源是影響菌株產(chǎn)酶的重要因素之一[28]。不同有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源(酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、花生餅粉)的存在能明顯影響酶的生產(chǎn)。如圖8所示，添加花生餅粉到培養(yǎng)基中，有最大的FPase酶活性。培養(yǎng)基中添加硝酸鈉有利于CMCase生產(chǎn)，而添加硫酸銨有利于β-Gase的生產(chǎn)。在這項(xiàng)研究中，有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源對(duì)酶活性的影響與前人的研究結(jié)果[29]相一致。宋賢沖等的研究報(bào)告指出，蛋白胨作為氮源最適合綠色木霉生產(chǎn)CMCase[30]。

3　結(jié)論與討論

赭綠青霉菌ZH1菌株固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，在自然補(bǔ)給氧氣的條件下，對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果為培養(yǎng)基pH值為4，并保持料水體積比為1.0 ∶3.0，最佳氮源為花生餅粉，接種量為0.5 mL，稻草底物粒徑為0.250～0.425 mm，有利于纖維素酶活性的提高；在此條件下72 h是適宜的發(fā)酵周期。

參考文獻(xiàn)：

[1]Malherbe S，Cloete T E. Lignocellulose biodegradation：fundamentals and applications[J]. Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2002，1(2)：105-114.

[2]John R P，Nampoothiri K M，Pandey A. Fermentative production of lactic acid from biomass：an overview on process developments and future perspectives[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，74(3)：524-534.

[3]H?lker U，H?fer M，Lenz J. Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64(2)：175-186.

[4]Robinson T，Singh D，Nigam P. Solid-state fermentation：a promising microbial technology for secondary metabolite production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55(3)：284-289.

[5]Takó M，Kotogán A，Krisch J，et al. Enhanced production of industrial enzymes inMucoromycotinafungi during solid-state fermentation of agricultural wastes/by-products[J]. Acta Biologica Hungarica，2015，66(3)：348-360.

[6]Li W Y，Ang T N，Ngoh G C，et al. Fungal solid-state fermentation and various methods of enhancement in cellulase production[J]. Biomass & Bioenergy，2014，67(5)：319-338.

[7]楊林麗. 纖維素降解菌篩選及混合菌種纖維素降解能力測(cè)定[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[8]曲音波. 木質(zhì)纖維素降解酶系的基礎(chǔ)和技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(10)：161-162.

[9]殷中偉. 秸稈纖維素高效降解菌株的篩選及對(duì)秸稈降解效果初步研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[10]Yang W P，Meng F X，Peng J Y，et al. Isolation and identification of a cellulolytic bacterium from the Tibetan pig’s intestine and investigation of its cellulase production[J]. Electronic Journal of Biotechnology，2014，17(6)：262-267.

[11]Fei Q，Zhang S Y，Gao P J. Purification and identification ofSporocytophagabacter[J]Journal of Shandong University，1999，34(4)：484-485.

[12]Bergadi F E，Laachari F，Elabed S，et al. Cellulolytic potential and filter paper activity of fungi isolated from ancients manuscripts from the Medina of Fez[J]. Annals of Microbiology，2014，64(2)：815-822.

[13]Elghonemy D H，Ali T H，Elbondkly A M，et al. Improvement ofAspergillusoryzaeNRRL 3484 by mutagenesis and optimization of culture conditions in solid-state fermentation for the hyper-production of extracellular cellulase[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2014，106(5)：853-864.

[14]El-Deen A M N，Shata H M A H，F(xiàn)arid M A F. Improvement ofβ-glucosidase production by co-culture ofAspergillusniger，andA.oryzae，under solid state fermentation through feeding process[J]. Annals of Microbiology，2014，64(2)：627-637.

[15]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[16]Varga I，Poczai P，Cernák I，et al. Application of direct PCR in rapid rDNA ITS haplotype determination of the hyperparasitic fungusSphaeropsisvisci(Botryosphaeriaceae)[J]. Springerplus，2014，3(1)：569.

[17]Qaisar S，Zohra R R，Aman A，et al. Enhanced production of cellulose degrading CMCase by newly isolated strain ofAspergillusversicolor[J]. Carbohydrate Polymers，2014，104(8)：199-203.

[18]Garcia N F L，Santos F R D S，Gon?alves F A，et al. Production ofβ-glucosidase on solid-state fermentation byLichtheimiaramosain agroindustrial residues：characterization and catalytic properties of the enzymatic extract[J]. Electronic Journal of Biotechnology，2015，18(4)：314-319.

[19]Prasetyo J，Sumita S，Okuda N，et al. Response of cellulase activity in pH-controlled cultures of the filamentous fungusAcremoniumcellulolyticus[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology，2010，162(1)：52-61.

[20]Irfan M，Syed Q，Yousaf M，et al. Studies on the pretreatment of wheat straw for improve production of carboxymethyl cellulase by thermophilicTrichodermaviride- FBL1 in solid state fermentation[J]. Academia Arena，2010，2(7)：18-30.

[21]Bhatti H N，Batool S，Afzal N. Production and characterization of a novelβ-glucosidase fromFusariumsolani[J]. International Journal of Agriculture & Biology，2013，15(1)：140-144.

[22]Raza F，Raza N A，Hameed U，et al. Solid state fermentation for the production ofβ-glucosidase by co-culture ofAspergillusnigerandA.oryzae[J]. Pak J Bot，2011，43(1)：75-83.

[23]Irfan M，Nadeem M，Syed Q. Influence of nutritional conditions for endoglucanase production byTrichodermaviridein SSF[J]. Global Journal of Biotechnology & Biochemistry，2012，7(1)：07-12.

[24]Huang Y，Qin X，Luo X M，et al. Efficient enzymatic hydrolysis and simultaneous saccharification and fermentation of sugarcane bagasse pulp for ethanol production by cellulase fromPenicilliumoxalicum，EU2106 and thermotolerantSaccharomycescerevisiae，ZM1-5[J]. Biomass & Bioenergy，2015，77：53-63.

[25]Mehboob N，Asad M J，Asgher M，et al. Exploring thermophilic cellulolytic enzyme production potential ofAspergillusfumigatusby the solid-state fermentation of wheat straw[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，172(7)：3646-3655.

[26]Krishna C. Solid-state fermentation systems -an overview[J]. Critical Reviews in Biotechnology，2005，25：1-30.

[27]Xin F X，Geng A L. Horticultural waste as the substrate for cellulase and hemicellulase production byTrichodermareeseiunder solid-statefermentation[J].AppliedBiochemistryand Biotechnology，2010，162(1)：295-306.

[28]Maeda R N，da Silva M M P，Santa Anna L M M，et al. Nitrogen source optimization for cellulase production byPenicilliumfuniculosum，using a sequential experimental design methodology and the desirability function[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，161(1-8)：411-422.

[29]Zhou H，Wang C Z，Ye J Z，et al. Solid-state fermentation ofGinkgobilobaL. residue for optimal production of cellulase，protease and the simultaneous detoxification ofGinkgobilobaL. residue usingCandidatropicalisandAspergillusoryzae[J]. European Food Research and Technology，2015，240(2)：379-388.

[30]宋賢沖，唐健，鄧小軍，等. 產(chǎn)纖維素酶真菌的分離篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，32(3)：372-378.