酵母葡聚糖抑菌活性初探

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(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院,河南 鄭州 450011)

酵母葡聚糖是一種具有很強的免疫活性類多糖，其免疫活性可增強機體對細菌、真菌、病毒及寄生蟲的抵抗感染能力，同時在促進機體傷口愈合和加強機體抗輻射等方面都具有顯著的作用, 是一種優(yōu)良的生物調(diào)節(jié)劑( BRMs) 。目前國內(nèi)外學者通過生物酶處理和化學修飾的方法增溶酵母葡聚糖，但對酵母葡聚糖的抑菌性研究則偏少, 本試驗就酵母多糖對細菌的抑菌效果進行初步探討，為其后期的研究及實踐應用推廣提供一定的理論參考。

1　材料

1.1　菌種

啤酒酵母、大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌等,由西北農(nóng)林科技大學微生物實驗室饋贈。

1.2　各種培養(yǎng)基的制備

酵母菌培養(yǎng)基: 酵母粉30g、瓊脂45g、葡萄糖40g、蛋白胨45g、蒸餾水1500 mL、pH6.3、121℃高壓滅菌30min；霉菌培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖30g、水1000mL,煮沸30min，pH6.7，121℃高壓滅菌30min。細菌培養(yǎng)基: 蛋白胨20g、瓊脂40g、牛肉膏10g、NaCl 10g、蒸餾水1000 mL、pH7.3，121℃高壓滅菌30min。

1.3　酵母葡聚糖的制備

稱取酵母粉1000g溶于1000mL、6%的NaOH溶液中,加熱攪拌4h,冷卻至室溫，離心(4000 r/min，30min)；吸棄上清液，將溶解的酵母用1000mL、3%的NaOH溶液進行懸浮, 然后將其加熱至90℃劇烈攪拌1.5h, 待冷卻至室溫后離心(4000r/min，30min)；吸棄上清液，然后加入11%的HCl充分混勻，室溫靜置2h，離心(4000 r/min，30min)；吸棄上清液，首先用H2O2洗滌3次，95%乙醇浸洗1.5h, 再用無水乙醇脫水3次, 37℃干燥12h, 所得酵母葡聚糖。

1.4　 酵母葡聚糖水溶液的制備

在所制得的酵母葡聚糖中添加一定比例的甲酸, 然后80℃降解1.5h后繼續(xù)加熱去除甲酸,待冷卻至室溫，對所得溶液通過超濾膜進行過濾，調(diào)節(jié)過濾濃縮液的pH值至7；65℃處理濃縮液20min后，將其冷凍干燥即可獲得易溶于水的酵母葡聚糖, 配制濃度45mg/mL酵母葡聚糖溶液以備用。

2　方法

2.1　菌懸液的制備

將菌種接種于培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)皿上作以標記。細菌、霉菌和酵母菌分別置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)24h。分別挑取已經(jīng)活化的菌種置入無菌生理鹽水中,搖勻，制成菌懸液，調(diào)整其濃度為106-107cfu/mL，以備用。

2.2　酵母葡聚糖最低抑菌濃度的測定

將酵母葡聚糖水溶液分別稀釋成濃度為 20、10、5、2.5、1.25 和0.625 mg/mL的稀釋液, 分別吸取各稀釋液0.5 mL和菌懸液0.1 mL, 加在固體培養(yǎng)基上，混合后加熱至60℃，充分混勻，待其冷卻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行觀察、培養(yǎng)，以不生長細菌的酵母葡聚糖溶液最低濃度為最小抑菌濃度(見表1)。

表1　酵母葡聚糖溶液最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)

注：“-”表示無菌生長；“**”表示有少量菌落生長；“***”表示有不超過1/3平皿面積的菌落生長；“****”表示有不超過1/2平皿面積的菌落生長；“*****”表示有超過1/2平皿面積的菌落生長。

2.3　pH值對酵母葡聚糖抑菌效果的影響

取5mL其濃度為106-107cfu/mL的酵母葡聚糖溶液于燒杯中，用0.1mol/mL的NaOH和 0.1mol/mL的HCl，調(diào)制成不同pH值的酵母葡聚糖溶液：pH分別為 3、4、5、6、7、8。將濾紙片(121℃高壓滅菌、30 min)放入其中均浸泡30min，水作為空白對照。得出不同pH 值對酵母葡聚糖抑菌效果的影響(見表2)。

表2　pH值對酵母葡聚糖抑菌效果的影響(n=6)

2.4　溫度對酵母葡聚糖抑菌效果的影響

分別吸取5mL其濃度為106-107cfu/mL的酵母葡聚糖溶液入4個燒杯中, 將濾紙片(121℃高壓滅菌、30 min)放入其中，分別在25、50、75和100℃水中浸泡60min, 檢測不同溫度情況下濾紙片抑菌圈的大小(見表3)。

表3　不同溫度對酵母葡聚糖抑菌效果的影響(n=6)

3　結(jié)果與分析

由表2可看出，酵母葡聚糖對枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為10、10、20和20mg/mL，隨著溶液濃度的不斷增加，其抑菌效果也隨之增強。酵母葡聚糖對細菌的抑制作用依次為：大腸桿菌<沙門氏菌<枯草芽孢桿菌<金黃色葡萄球菌；由表3可看出, 溫度對酵母葡聚糖的抑菌作用有一定的影響, 隨著溫度的升高,酵母葡聚糖的抑菌效果也增加。由表4可看出, pH值在6.0-7.0范圍內(nèi)時,酵母葡聚糖抑菌效果最為明顯，同時被視為酵母葡聚糖抑菌的最適pH值。實驗結(jié)果顯示：酵母葡聚糖對黑曲霉和啤酒酵母沒有明顯的抑制作用，而對大腸桿菌則具有明顯的抑制作用；溫度對酵母葡聚糖的抑菌效果呈正相關(guān)；pH值也影響酵母葡聚糖的抑菌效果,在pH6.7時,酵母葡聚糖的抑菌效果最好。

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