鄒嶺，陳偉，李自慧，葉甲舟，白濤，陳潔，陳健康，王翠，劉寧，楊曉麗，吳飛翔

1.廣西醫(yī)科大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧 5300021；2.湘南學(xué)院 附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000；3.中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院 檢驗科，北京 100071

趨化因子CXCL1（chemokine CXC motif li? gand 1）屬于CXC亞族[1]。CXCL1不僅與炎癥反應(yīng)有關(guān)，而且CXCL1及其受體CXCLR2直接影響某些腫瘤惡性轉(zhuǎn)變、存活及生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。CXCL1也間接影響血管生成及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的形成[2-3]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）時，會影響腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的活性，釋放細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤炎癥反應(yīng)，或通過募集血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)腫瘤血管生成，恢復(fù)腫瘤微環(huán)境[4-7]。目前尚未有對細(xì)胞因子中趨化因子與腫瘤細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)行詳細(xì)研究的報道。在此，我們探討了人肝癌HepG2細(xì)胞中CXCL1過表達(dá)情況下對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所鐘輝課題組惠贈，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，于含95%空氣和5%CO2的37℃恒溫箱里培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次，用于實驗的細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期。

青霉素、鏈霉素購自華北制藥有限公司；人CXCL1 ELISA試劑盒、衣霉素（tunicamycin，TM）、丙二醇甲醚醋酸酯（TPA）、DMSO購自Sigma-Al?drich公司；焦碳酸二乙脂（DEPC）購自上海生工生物工程公司；TRNzol-A+總RNA提取試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版（SYBR Green）購自天根生化科技有限公司；異丙醇、氯仿、75%乙醇購自西瓏化工公司；細(xì)胞凍存管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶購自Corning公司；TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis試劑盒購自全式金生物技術(shù)公司；EP管、無RNase的PCR管、0.2 mL八連排透明PCR薄壁管購自Axygen公司。

1.2 ERS相關(guān)蛋白基因引物設(shè)計與合成

每種基因選2～3個已報道且多次被引用的引物，通過熒光定量PCR分析溶解曲線，篩選出無二級結(jié)構(gòu)、特異性較好的引物，作為后續(xù)實驗所用引物（表1）。

表1 引物序列信息

1.3 人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)HepG2細(xì)胞長至6 cm培養(yǎng)皿的60%～80%時可用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換新鮮培養(yǎng)基2 mL（平時培養(yǎng)基的一半）；把2 μL LipofectAMINE 2000加入100 μL生理鹽水中（轉(zhuǎn)染試劑∶生理鹽水為1∶50）靜置5 min；向另一100 μL生理鹽水中加入2 μg CXCL1質(zhì)粒，再把2 μL轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000和100 μL生理鹽水混合液加進(jìn)來，靜置15 min；最后把2 μg CXCL1質(zhì)粒、2 μL轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000和100 μL生理鹽水的轉(zhuǎn)染混合液均勻加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻；4 h后補(bǔ)2 mL新鮮培養(yǎng)基或換成4 mL新鮮培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞提取mRNA。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR測定HepG2細(xì)胞中IRE1、PERK、ATF6 mRNA的表達(dá)。提取HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄，85℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Su?perReal Color PreMix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，無RNase的ddH2O 3 μL。各樣品均以β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

用Bio-Rad iQ5軟件分析數(shù)據(jù)，提取擴(kuò)增曲線及融解曲線，按下式計算樣本中各目的基因的相對表達(dá)量：ΔCT=CT（目的基因）-CT（內(nèi)參基因），其中CT為3個復(fù)孔平均值；ΔΔCT=ΔCT（實驗組）-ΔCT（對照組）。目的基因的相對表達(dá)量為2-ΔΔCT。用SPSS16.0軟件，采用單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行比較，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GFP-CXCL1質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果見圖1，質(zhì)粒GFP-CXCL1瞬時轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞HepG2中，24 h后在熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光，表明GFP-CXCL1載體在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)。

圖1 GFP-CXCL1質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 熒光定量PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1、PERK、ATF6 mRNA的表達(dá)

在HepG2細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染GFP-CXCL1質(zhì)粒，過表達(dá) CXCL1，培養(yǎng) 24h后收集細(xì)胞提取mRNA，通過熒光定量PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1、PERK、ATF6的mRNA，結(jié)果見圖2。HepG2細(xì)胞過表達(dá)CXCL1后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平均升高，表明HepG2細(xì)胞過表達(dá)CXCL1后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活。

圖2 HepG2細(xì)胞過表達(dá)CXCL1后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

CXCL1是小分子趨化因子，能夠趨化中性粒細(xì)胞向炎癥部位運(yùn)動，此外還參與新血管生成、傷口愈合等生理病理過程[8-9]。近年來研究表明CXCL1在肺癌[10]、膀胱癌[11]、卵巢上皮癌[12]及前列腺癌[13]中表達(dá)增高，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。以肝癌為例，CXCL1可以通過NF-κB通路調(diào)控P65的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移[14]。腫瘤的發(fā)生往往伴有炎癥反應(yīng)，那么CXCL1如何參與炎性反應(yīng)，又如何通過與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移相聯(lián)系？研究發(fā)現(xiàn)CXCL1的存在可以影響巨噬細(xì)胞的生成，從而影響炎性反應(yīng)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。此外，Morizawa等[11]對膀胱癌的研究證實腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞存在于腫瘤微環(huán)境中，CXCX1可以增強(qiáng)它們的募集，影響腫瘤預(yù)后。阻斷CXCL1募集信號通路，可以在一定程度上治療膀胱腫瘤。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)生成和鈣離子貯存的主要場所。當(dāng)細(xì)胞環(huán)境由于生理或病理條件改變時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，細(xì)胞會采取相應(yīng)的應(yīng)答措施緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的恢復(fù)，這一反應(yīng)被稱為ERS[15]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生ERS時會激活UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。UPR信號主要通過3個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白負(fù)責(zé)監(jiān)控ERS并啟動UPR，這3個蛋白就是肌醇依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至細(xì)胞核信號激酶1α（IRE1α）、類RNA依賴蛋白激酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）及轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）[16]。正常狀態(tài)下，GRP78與PERK、IRE1及ATF6這3種感受器的ER腔部分結(jié)合在一起。ERS發(fā)生時, GRP78與未折疊蛋白結(jié)合，游離的IRE1、PERK分別通過各自細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的二聚化和自身磷酸化而被激活[17]；解離后的ATF6則轉(zhuǎn)入高爾基體被蛋白酶水解成活性轉(zhuǎn)錄因子，此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受器被激活，通過 PERK-eIF2α、IRE1-XBP1s和ATF6-ERSE這3條主要的信號通路參與UPR[18-21]。

我們將GFP-CXCL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞使其過表達(dá)，檢測與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的3個信號通路蛋白的表達(dá)水平，以此驗證CXCL1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響是否與這3個信號通路蛋白有關(guān)。結(jié)果HepG2細(xì)胞過表達(dá)CXCL1后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1、PERK、ATF6均升高。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一個復(fù)雜的過程，其分子機(jī)制還有很多不明之處，各種細(xì)胞因子如何參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控尚不明晰。本研究可為探討趨化因子對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響提供新的思路，并且為進(jìn)一步研究CXCL1促進(jìn)原發(fā)性肝癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制提供幫助。

[1] Miyake M,Lawton A,Goodison S,et al.Chemokine (C-X-C)ligand 1(CXCL1)protein expression is in?creased in aggressive bladder cancers[J].BMC Cancer, 2013,13:322.

[2] Petty A J,Yang Y.Tumor-associated macrophages:im?plications in cancer immunotherapy[J].J Immunother, 2017,9(3):289-302.

[3] Affo S,Yu L X,Schwabe R F.The role of cancer-as?sociated fibroblasts and fibrosisin liver cancer[J].An?nu Rev Phytopathol,2017,12:153-186.

[4] Maeng H J,Song J H,Kim G T,et al.Celecoxib-me?diated activation of endoplasmic reticulum stress induc?esde novo ceramide biosynthesisand apoptosisin hepatoma HepG2 cells[J].BMB Rep,2017,50(3):144-149.

[5] Guo Q,Xu L,Li H,et al.Progranulin causes adipose insulin resistance via increased autophagy resulting from activated oxidative stress and endoplasmic reticu?lum stress[J].Lipids Health Dis,2017,16(1):25.

[6] Lee B R,Chang S Y,Hong E H,et al.Elevated en?doplasmic reticulum stress reinforced immunosuppres?sion in the tumor microenvironment via myeloid-de?rived suppressor cells[J].Oncotarget,2014,5(23):12331-12345.

[7] Peters L R,Raghavan M.Endoplasmic reticulum calci?um depletion impacts chaperone secretion,innate im?munity,and phagocytic uptake of cells[J].J Immunol, 2011,187(2):919-931.

[8] Garg A D,Vandenberk L,Fang S,et al.Pathogen re?sponse-like recruitment and activation of neutrophils by sterile immunogenic dying cells drives neutrophilmediated residualcellkilling[J].CellDeath Differ, 2017,24(5):832-843.

[9] Wang W,Xu M J.Inflammation is independent of ste?atosis in a murine model of steatohepatitis[J].Hepatolo?gy,2017,66(1):108-123.

[10]YuanM,ZhuH.Tumor-derivedCXCL1promotes lung cancer growth via recruitment of tumor-associat?ed neutrophils[J].J Immunol Res,2016,2016:6530410.

[11]Miyake M,Hori S,Morizawa Y,et al.CXCL1-mediat?ed interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts pro?motes tumor progression in human bladder cancer[J]. Neoplasia,2016,18(10):636-646.

[12]WangQ,LiD.Evaluation ofproteomics-identified CCL18 and CXCL1 as circulating tumor markers for differential diagnosis between ovarian carcinomas and benign pelvic masses[J].Int J Biol Markers,2011,26 (4):262-273.

[13]Hardaway A L,Herroon M K.Marrow adipocyte-de?rived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer[J]. Clin Exp Metastasis, 2015,32(4):353-368.

[14]Cao Z,Fu B.Overexpression of Chemokine(C-X-C) ligand 1(CXCL1)associated with tumor progression and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Can?cer Cell Int,2014,14(1):86.

[15]Noack J,Choi J.A sphingosine kinase inhibitor com?bined with temozolomide induces glioblastoma cell death through accumulation of dihydrosphingosine and dihydroceramide,endoplasmic reticulum stress and au?tophagy[J].Cell Death Dis,2014,5:e1425.

[16]Verfaillie T,Garg A D,Agostinis P.Targeting ER stress induced apoptosis and inflammation in cancer [J].Cancer Lett,2013,332(2):249-264.

[17]Smith W W,Jiang H,Pei Z,et al.Endoplasmic retic?ulum stress and mitochondrial cell death pathways me?diate A53T mutant alpha-synuclein-induced toxicity [J].Hum Mol Genet,2005,14(24):3801-3811.

[18]Katayama T,Imaizumi K,Honda A,et al.Disturbed activation of endoplasmic reticulum stress transducers by familialAlzheimer'sdisease-linked presenilin-1 mutations[J].J Biol Chem,2001,276(46):43446-43454.

[19]Hoozemans J J,van Haastert E S.The unfolded pro?tein response is activated in pretangle neurons in Al?zheimer's disease hippocampus[J].Am J Pathol,2009, 174(4):1241-1251.

[20]Culmsee C,LandshamerS.Molecularinsightsinto mechanisms of the cell death program:role in the pro?gression ofneurodegenerative disorders[J].Curr Al?zheimer Res,2006,3(4):269-283.

[21]Acosta-Alvear D,Zhou Y,Blais A,et al.XBP1 con?trols diverse cell type- and condition-specific tran?scriptional regulatory networks[J].Mol Cell,2007,27(1): 53-66.