李備，周穎，常秀亭，羅小菊，云永歡，曹獻英

1.海南省食品檢驗檢測中心，海南 ?？?570311；2.海南大學 食品學院，海南 ?？?570228

中藥高良姜具有散寒止嘔、溫胃止痛的功效，二苯基庚烷類化合物是其重要的生物活性成分，在抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出較好的藥理活性[1-5]。5-羥基-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮（DPHA）是高良姜中重要的二苯基庚烷類成分（結(jié)構(gòu)式見圖1），具有上述活性[6-12]。本研究建立了測定大鼠血漿中DPHA濃度的LC-MS/MS方法，為高良姜二苯庚烷類成分的藥動學研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD大鼠（10周齡，體重240±20 g）由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供［動物合格證號：SCXK（湘）2014-0011］。

Prominence UFLC液相色譜儀（日本島津公司）通過Turbo V離子源接口串聯(lián)AB-SCIEX API 4000+串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，Analyst軟件控制數(shù)據(jù)采集和處理（美國AB公司）；5922型冷凍離心機（日本Kubota公司）；XS105DU十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LabTow?er EDI15超純水一體機（美國熱電公司）；Vibrax圓周振蕩器（德國艾卡公司）；FDB03DD氮吹儀（英國Techne公司）；色譜級甲醇（德國默克公司）；色譜級正己烷和甲酸（阿拉丁試劑）。

1.2 供試品溶液的制備

精密稱取DPHA對照品適量，加甲醇配制成0.1 mg/mL的儲備液，4℃保存?zhèn)溆?。取益智酮甲對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成200 ng/mL內(nèi)標溶液。

1.3 血漿樣品采集處理

大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，臨用前禁食不禁水12 h，從眼眶靜脈叢采集血液樣品，肝素鈉抗凝，4000 r/min離心10 min獲得血漿，取50 μL血漿樣品加入1 mL正己烷，2000 r/min振蕩混勻10 min，離心后分取正己烷層950 μL，37℃加熱氮氣吹干，加入50 μL甲醇（含內(nèi)標益智酮甲200 ng/ mL）復溶，2000 r/min振蕩混勻3 min，13 000 r/ min離心10 min，取上清液置微量進樣管中，待進樣分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

菲羅門Kinetex XB-C18色譜柱（2.10 mm×50 mm，2.6 μm），柱溫40℃，以水（含0.01%甲酸，A）-甲醇（含0.01%甲酸，B）為流動相梯度洗脫［梯度洗脫程序：0～0.50 min（1%B），0.51～6.50 min（60%～100%B），6.51～8.00 min（1%B），流速0.30 mL/min，進樣量10 μL］。電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，噴霧電壓5500 V，GS1為55 psi，GS2為45 psi，簾氣為35 psi，噴霧溫度為500℃，碰撞氣為 10 psi。多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），用于定量分析的離子對為m/z 329.2→163.0，內(nèi)標化合物益智酮甲為313.1→137.0。

1.5 專屬性考察

取空白血漿、空白血漿加對照品和內(nèi)標溶液、靜脈注射給藥后30 min血漿樣品，按1.3項下樣品處理方法處理，按1.4項下條件進樣分析。

1.6 線性關(guān)系考察

取0.1 mg/mL DPHA甲醇溶液適量，用空白血漿配制成2000 ng/mL血漿樣品，再用空白血漿逐級稀釋成1000、100、10、5、2、1 ng/mL的血漿樣品，經(jīng)1.3項下方法處理后，進樣10 μL，按1.4項下方法進行分析。

圖1 5-羥基-7（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮

1.7 精密度和準確度考察

配制高、中、低3種濃度（1600、100、6 ng/mL）的DPHA血漿樣品，每個濃度設(shè)5個平行樣，經(jīng)1.3項下方法處理后分別進樣分析，計算日內(nèi)精密度和準確度，連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。

1.8 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率試驗

按文獻方法[13-14]，采用提取后添加法評定基質(zhì)效應(yīng)，同時考察提取回收率。Set1：取高、中、低3種濃度DPHA對照品溶液50 μL，直接進樣分析，得到峰面積A1；Set2：取空白血漿50 μL，經(jīng)2.3項下方法處理至氮氣37℃加熱吹干步驟，然后分別加入高、中、低3種濃度DPHA對照品溶液50 μL復溶，2000 r/min振蕩混勻3 min,13 000 r/min離心10 min，取上清液進樣分析，得到峰面積A2；Set3：配制高、中、低3種濃度DPHA血漿樣品，各取50 μL經(jīng)1.3項下方法處理后進樣分析，得到峰面積A3。以上每個濃度設(shè)5個平行樣?；|(zhì)效應(yīng)ME=A2/A1×100%；提取回收率RE=A3/A2× 100%。

1.9 穩(wěn)定性考察

配制高、中、低3種濃度的DPHA血漿樣品，每個濃度設(shè)5個平行樣，考察血漿樣品在室溫放置4 h、凍融循環(huán)3次和血漿樣品處理后置自動進樣器中8 h的穩(wěn)定性，經(jīng)1.3項下方法處理后分別進樣分析，計算樣品短期穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察結(jié)果

DPHA、益智酮甲出峰時間分別為3.91、4.90 min，分離度大于1.5，空白溶劑和基質(zhì)對測定無干擾。色譜圖見圖2。

圖2 DPHA（1）和內(nèi)標益智酮甲（2）色譜圖A：空白血漿；B：空白血漿加DPHA；C：空白血漿加內(nèi)標；D：空白血漿加DPHA和內(nèi)標；E：靜脈注射給藥30 min后血漿樣品

2.2 線性考察結(jié)果

以待測物與內(nèi)標峰面積之比（y）為縱坐標、待測物濃度（x）為橫坐標、權(quán)重為1/x進行線性回歸，得回歸方程y=0.00119x+0.000409（r=0.9996），表明DPHA為1～2000 ng/mL時線性關(guān)系良好。

2.3 精密度和準確度考察結(jié)果

研究結(jié)果（表1）顯示，日內(nèi)、日間精密度RSD均低于15%，重復性良好；準確度為105.03%～112.80%。

表1 DPHA定量分析精密度和準確度結(jié)果

2.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率試驗結(jié)果

結(jié)果（表2）表明，高、中、低3種濃度下，待測物均無顯著的基質(zhì)效應(yīng)，提取回收率大于70%。

表2 大鼠血漿中DPHA的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率（n=5）

2.5 穩(wěn)定性考察結(jié)果

各濃度樣品測試的準確度為 102.46%～110.60%，小于15%；3種處理方式對樣品穩(wěn)定性無明顯影響。結(jié)果見表3。

表3 血漿樣品中DPHA的穩(wěn)定性

2.6 樣品測試

將上述分析方法用于分析大鼠給藥后血漿樣品。取4只SD大鼠，尾靜脈注射給予DPHA 1.0 mg/kg，0.5 h后經(jīng)眼眶靜脈取血，按1.3項下方法處理后分別進樣分析，計算得血藥濃度為36.2±5.1 ng/mL（n=4，RSD=14.0%）。

3 討論

DPHA結(jié)構(gòu)與姜黃素類似，一般而言姜黃素類似物溶解性、穩(wěn)定性較差，應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析這些化合物在血漿中的含量，文獻報道基質(zhì)效應(yīng)為43%～86%，對結(jié)果的準確性存在一定影響[14-15]。本研究建立的DPHA液相色譜-質(zhì)譜分析方法，基質(zhì)效應(yīng)為99.63%～110.50%，方法的建立過程中，還考察優(yōu)化了離子源噴霧電壓、GS1、GS2、簾氣、噴霧溫度等參數(shù)。對血漿樣品的處理，通過試驗對比了甲醇、乙腈沉淀和乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚萃取，最后確定正己烷萃取處理后檢測干擾少、提取率高。同時設(shè)定了3對 離 子 對（329.2→163.0、329.2→137.0、392.2→311.0）檢測分析DPHA，其中392.2→311.0信號最強，但干擾峰較多，最后選擇信號稍弱而干擾較少的329.2→163.0作為定量分析的離子對。以上結(jié)果為DPHA的藥代動力學研究奠定了基礎(chǔ)，也為相關(guān)藥效藥理研究的給藥劑量提供了參考。

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