劉文山，劉立輝，傅榮昭

邦泰生物工程（深圳）有限公司，廣東 深圳 518102

畢赤酵母由于其強(qiáng)大的分泌表達(dá)能力，已經(jīng)成為最常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，利用畢赤酵母表達(dá)各種的蛋白和酶類已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)和食品等領(lǐng)域[1]。此外，畢赤酵母已被美國食品藥品管理局（FDA）認(rèn)定為 GRAS（GenerallyRecog?nized as Safe）微生物，畢赤酵母表達(dá)的乳糖酶也在國內(nèi)被批準(zhǔn)用于食品行業(yè)?？梢灶A(yù)期，越來越多的食品用酶將可以通過畢赤酵母生產(chǎn)。

對于食品用酶而言，其安全評(píng)價(jià)至關(guān)重要，不僅要求生產(chǎn)菌株的安全性，而且還要求其不能含有非食品級(jí)菌種來源的功能性DNA片段[2]。然而，目前所使用的絕大多數(shù)畢赤酵母表達(dá)載體最終均將大腸桿菌來源的抗性標(biāo)記和大腸桿菌復(fù)制區(qū)整合到了酵母基因組上，這對于食品安全而言是不利的。pAO815和pPink系列載體雖然在酵母中不用抗性篩選，但也含有大腸桿菌的氨芐青霉素或卡那霉素抗性標(biāo)簽及大腸桿菌復(fù)制區(qū)，并最終整合到酵母基因組上。因此，我們嘗試開發(fā)一種產(chǎn)生高拷貝但不會(huì)將這些細(xì)菌來源的DNA片段整合到酵母基因組上的質(zhì)粒。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α用于克隆，采用LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)；畢赤酵母菌株GS115用于提取基因組擴(kuò)增ADE2基因；畢赤酵母GS115Δade2由本公司保存，作為蛋白表達(dá)宿主，在YPD培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)；DNA聚合酶為南京諾唯贊生物科技有限公司的Phanta高保真酶；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均來源于天根公司；蛋白marker為Thermo的PageRuler；DNA marker、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均來源于TaKaRa公司；引物及序列見表1。

1.2 pMA的構(gòu)建

pMA構(gòu)建流程如圖1所示。分別PCR擴(kuò)增如下片段：①片段1：AOX1啟動(dòng)子的5'端（BglⅡ和SacⅠ之間的部分，209 bp），以pPIC9k為模板，采用引物1和2擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）；②片段2：Amp抗性標(biāo)簽和pUC復(fù)制區(qū)（1762 bp），以pPIC9K為模板，采用引物3和4擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）；③片段3：AOX1啟動(dòng)子的SacⅠ位點(diǎn)到AOX1終止子（1414 bp），以pPIC9k為模板，采用引物5和6擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min；④片段4：ADE2篩選標(biāo)記（1927 bp，3'端加入BglⅡ位點(diǎn)），以GS115基因組為模板，采用引物7和8擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）。

表1 PCR引物列表

用凝膠回收試劑盒回收上述片段，各取1 μL混合后作為模板，進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）。將擴(kuò)增得到的片段用BglⅡ酶切，回收后用T4DNA連接酶自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對AOX1啟動(dòng)子到AOX1終止子部分測序正確后保存，將該載體命名為pMA。

1.3 表達(dá)載體pMA-AOLAC的構(gòu)建

以pETAOLAC（含有來源于米曲霉的β-半乳糖甘酶表達(dá)基因，GenBank登錄號(hào)為E12172，兩端分別為EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)）為模板，用EcoRⅠ和NotⅠ酶切后插入pMA的EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，利用引物9和10進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pMA-AOLAC。

1.4 重組酵母的構(gòu)建

酵母轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法[3]，電轉(zhuǎn)條件為0.2 mm電轉(zhuǎn)杯，1500 V電壓。電擊完成后涂布MD平板（1.34 g/L YNB，2%葡萄糖，0.4 mg/L生物素，50 mg/L組氨酸），30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取白色轉(zhuǎn)化子接種到新的MD平板上，并用引物9和10進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.5 蛋白表達(dá)及檢測

重組酵母接種于BMGY培養(yǎng)基（10 g/L酵母提取物，20 g/L胰蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀溶液，1%甘油，1.34 g/L YNB，0.4 mg/L生物素）中，30℃培養(yǎng)至D600nm為2～6，3000 r/min離心5 min，將菌體重懸到BMMY培養(yǎng)基（將BMGY中的甘油替換為0.5%甲醇）中于30℃培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加一次0.5%甲醇，96 h后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。β-半乳糖甘酶活性測定采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法[4]，一個(gè)單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol鄰硝基苯酚所需酶量。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pMA的構(gòu)建

載體的構(gòu)建如圖1，通過重疊延伸PCR將AmpR+ori片段插入AOX1啟動(dòng)子的SacⅠ位點(diǎn)（片段1和片段2之間），并將ADE2表達(dá)框插入AOX1終止子的3'端。各片段PCR回收后瓊脂糖凝膠電泳如圖2A所示。將最終PCR產(chǎn)物用BglⅡ酶切，連接后得到的載體命名為pMA。

2.2 β-半乳糖苷酶重組表達(dá)菌株的構(gòu)建及表達(dá)分析

圖1 載體pMA的構(gòu)建

將來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶編碼基因插入pMA的EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，將構(gòu)建的載體命名為pMA-AOLAC。該載體經(jīng)SacⅠ酶切后切除AmpR+ori片段，回收AOX1啟動(dòng)子3'端-α信號(hào)肽-AOLAC-AOX1終止子-ADE2表達(dá)框-AOX1啟動(dòng) 子 5'端（圖 2B），用 于 轉(zhuǎn) 化 畢 赤 酵 母GS115Δade2。挑取白色轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證（圖3A）后保存到甘油管中。挑取2株陽性克隆進(jìn)行發(fā)酵測試，結(jié)果如圖3B，可見明顯的蛋白表達(dá)條帶，經(jīng)測定發(fā)酵液最高酶活為380 U/mL。

3 討論

畢赤酵母常用載體如pPIC系列載體一般采用G418或博來霉素等抗性標(biāo)記進(jìn)行高拷貝篩選，有些載體還帶有一個(gè)大腸桿菌的氨芐青霉素或卡那霉素的抗性標(biāo)記。這些抗性標(biāo)記如氨芐青霉素、卡那霉素、博來霉素、潮霉素等的抗性基因大多來源于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子[5-7]，最終構(gòu)建的重組菌株均將這些標(biāo)記基因及大腸桿菌復(fù)制區(qū)整合到了酵母基因組上。對于表達(dá)食品用酶來說，這些片段通常是不允許的。此外，這些載體包含過多的元件使載體偏大，不利于載體構(gòu)建和整合。這些基因還可能轉(zhuǎn)移到環(huán)境中的其他微生物中，從而造成危害。

圖2 pMA各片段的PCR擴(kuò)增（A）及驗(yàn)證（B）M：DNA marker；1～5：分別為片段1、2、3、4和1～4重疊PCR產(chǎn)物；6：pMA的雙酶切驗(yàn)證；7：pMA的SacⅠ線性化

圖3 重組酵母菌株的菌落PCR驗(yàn)證（A）及發(fā)酵液的SDS-PAGE檢測（B）M1：DNA marker；M2：蛋白 marker；1～5：不同的轉(zhuǎn)化子；6：GS115Δade2/pMA；7，8：GS115Δade2/pMA-AOLAC的1、2號(hào)轉(zhuǎn)化子

為了使大腸桿菌來源的片段不整合到酵母基因組，我們以pPIC9K為模板，將氨芐青霉素抗性基因AmpR和大腸桿菌復(fù)制區(qū)ori插入AOX1啟動(dòng)子的SacⅠ位點(diǎn)。這樣在進(jìn)行基因組整合時(shí)，用SacⅠ酶切載體即可將該AmpR+ori片段切除，將該片段以外的部分整合到AOX1位點(diǎn)。為了避免使用G418抗性標(biāo)記篩選而達(dá)到高拷貝的整合，我們采取pPINK載體的思路，將G418抗性基因替換為ADE2表達(dá)框。ADE2表達(dá)框來源于畢赤酵母基因組，包含截短ADE2啟動(dòng)子的部分序列、ADE2編碼基因及其終止子。其中截短的啟動(dòng)子僅具有微弱的轉(zhuǎn)錄活性，從而必須產(chǎn)生多拷貝才能滿足ADE2缺陷菌株對該酶的需求[8]。最終，除了目標(biāo)基因以外，單次整合到基因組上的片段僅3.6 kb，遠(yuǎn)小于pPIC系列載體。除了將AmpR+ori片段插入AOX1中間，還可以將其插入ADE2的中間，最終將目標(biāo)片段整合到基因組的ADE2位點(diǎn)。我們后續(xù)還會(huì)考慮將甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動(dòng)子替換為GAP等組成型啟動(dòng)子。為了驗(yàn)證載體pMA的實(shí)用性，我們利用該載體表達(dá)來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶，結(jié)果達(dá)到了較高的表達(dá)水平。后續(xù)我們將利用該系統(tǒng)嘗試表達(dá)不同的食品用酶，以降低一些食品用酶的生產(chǎn)成本。

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