王慧嶺，羅建濤，白雪梅，滕 杰，張晉陽，劉敏勝

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065001)

二十碳五烯酸(EPA)在預(yù)防和治療人類多種疾病(如心血管疾病、癌癥和炎癥性疾病)方面有顯著作用，而且還能起到延緩衰老的生理作用[1]。目前EPA的唯一商業(yè)來源是深海魚油，但存在味道、氣味和穩(wěn)定性等問題。此外，魚油中大量的其他多不飽和脂肪酸使得EPA的提純更為復(fù)雜，導(dǎo)致純品的價(jià)格很高[2]。

許多海洋微藻都有較高的EPA含量，其中很多微藻是重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻，Nannochloropsisoceanica易培養(yǎng)，是海產(chǎn)苗種生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一種餌料微藻[3]。在澳大利亞和以色列等國(guó)家，微綠球藻被規(guī)?；囵B(yǎng)用于生產(chǎn)高純度的EPA[4]。規(guī)?；囵B(yǎng)微藻生產(chǎn)EPA受到許多因素的影響，如光照、溫度、鹽度、酸堿度、營(yíng)養(yǎng)方式等。筆者探討了微藻規(guī)模化生產(chǎn)EPA的最佳條件，旨在為EPA的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1藻種與培養(yǎng)基試驗(yàn)所用藻種ENN1001A，由新奧科技發(fā)展有限公司藻種庫(kù)提供。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保種和培養(yǎng)均采用消毒水配制的f/2培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1溫度對(duì)ENN1001A EPA含量的影響。將試驗(yàn)藻株先活化3 d，接入內(nèi)徑5 cm、高50 cm的玻璃管式反應(yīng)器中，養(yǎng)殖體積800 mL，初始濃度為OD750=2.0，光照強(qiáng)度(100±10)μmol/(m2·s)，光暗比16∶8；通入空氣與CO2的混合氣體，CO2含量為2%，通氣量為0.1 L/min；設(shè)置10、15、20、23、27、30、33、37、40 ℃共9個(gè)溫度梯度，分別用冷暖水機(jī)控制溫度恒定在設(shè)定溫度，每個(gè)溫度梯度3個(gè)重復(fù)，每天08：30停氣，補(bǔ)水至原體積，充分混合30 min后，取樣，測(cè)定干重。培養(yǎng)2 d后，于15、20、30、40 ℃離心、洗滌收集藻泥后冷凍干燥，藻粉用于脂肪酸分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次試驗(yàn)的平均值。由于養(yǎng)殖體系為實(shí)驗(yàn)室管式反應(yīng)器，所以遵循業(yè)內(nèi)室內(nèi)產(chǎn)量計(jì)算方式，以g/(L·d)計(jì)。

1.2.2液位對(duì)溫度的影響。試驗(yàn)藻株來自戶外規(guī)?；宸N擴(kuò)培室，接入養(yǎng)殖面積為180 m2開放式跑道池，養(yǎng)殖深度設(shè)為15、20、25 cm，攪拌速度以液體流速來控制，藻液平均流速控制在0.4 m/s。自然條件下培養(yǎng)(內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗10月)，通入CO2氣體，控制pH在7.0～8.0，每個(gè)液位養(yǎng)殖1個(gè)跑道池，養(yǎng)殖濃度為100 g/m2，使用在線系統(tǒng)24 h監(jiān)測(cè)記錄各液位下藻液溫度及空氣溫度，連續(xù)監(jiān)測(cè)30 d，溫度差異以30 d各養(yǎng)殖池平均溫度計(jì)。

1.2.3EPA的規(guī)?；a(chǎn)。試驗(yàn)藻株來自戶外規(guī)?；B(yǎng)殖藻種，接入養(yǎng)殖面積為1 200 m2開放式跑道池，養(yǎng)殖深度隨季節(jié)的變化適時(shí)調(diào)整，調(diào)整原則為不增加外部能耗和不降低生物質(zhì)產(chǎn)量的前提下，盡可能控制藻液溫度在15～25 ℃，養(yǎng)殖濃度控制在1.0～1.5 g/L，攪拌速度以液體流速來控制，藻液平均流速控制在0.4 m/s。自然條件下培養(yǎng)(內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗4—10月)，通入CO2氣體，控制pH在7.0～8.0，溫度記錄使用在線系統(tǒng)24 h監(jiān)測(cè)記錄。每天16:30補(bǔ)水測(cè)量干重，根據(jù)生物量增長(zhǎng)情況采收，并補(bǔ)充等量營(yíng)養(yǎng)鹽，采收藻粉噴霧干燥，每月生產(chǎn)藻粉混合均勻后，取樣進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)，EPA產(chǎn)量由單位面積養(yǎng)殖藻粉量乘以該月藻粉EPA含量計(jì)算獲得。

2　結(jié)果與分析

2.1溫度對(duì)ENN1001A生長(zhǎng)及EPA產(chǎn)量的影響

2.1.1溫度對(duì)ENN1001A生長(zhǎng)的影響。在室內(nèi)恒定光照強(qiáng)度100 μmol/(m2·s)條件下，5 cm管式反應(yīng)器通氣培養(yǎng)測(cè)得溫度對(duì)ENN1001A生長(zhǎng)的影響(圖1)。恒定溫度下，連續(xù)養(yǎng)殖2 d，10～27 ℃內(nèi)，隨著溫度的上升,ENN1001A平均產(chǎn)量增加，23～27 ℃下ENN1001A產(chǎn)量基本相當(dāng)。當(dāng)溫度超過30 ℃，其生長(zhǎng)明顯受到抑制。當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，ENN1001A幾乎不生長(zhǎng)，40 ℃時(shí)細(xì)胞死亡。

圖1　溫度對(duì)ENN1001A生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effects of temperature on the growth of ENN1001A

2.1.2溫度對(duì)ENN1001A EPA含量的影響。從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，EPA含量逐漸降低。當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)EPA含量最高(3.7%)，當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)EPA含量略有降低，為3.4%；當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)EPA含量略有降低，為3.3%；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)EPA含量降至1.6%。

圖2　溫度對(duì)ENN1001A EPA含量的影響Fig.2　Effects of temperature on EPA content in ENN1001A

從圖3可以看出，當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)EPA總產(chǎn)量最高，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)EPA產(chǎn)量也高于溫度15 ℃時(shí)，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)由于不能正常生長(zhǎng)，所以EPA產(chǎn)量為負(fù)值。

圖3　不同溫度條件下ENN1001A EPA產(chǎn)量Fig.3　EPA yield of ENN1001A under different temperature conditions

2.2液位對(duì)溫度的影響對(duì)2013年10月份內(nèi)蒙古達(dá)拉特旗養(yǎng)殖藻液各時(shí)間段測(cè)得的溫度進(jìn)行計(jì)算，養(yǎng)殖液位對(duì)藻液溫度的影響見圖4。從圖4可以看出，20：00—次日10：00，隨著養(yǎng)殖液位的增加，藻液溫度隨之增加；在20：00和次日10：00 3個(gè)液位梯度的溫度一致，而10：00—20：00，隨著養(yǎng)殖液位的增加，藻液溫度降低，當(dāng)液位為15與25 cm時(shí)最高溫度相差3 ℃。

圖4　養(yǎng)殖液位對(duì)藻液溫度的影響Fig.4　Effects of aquaculture liquid level on the temperature of algae fluid

2.3EPA的規(guī)?；a(chǎn)對(duì)2016年內(nèi)蒙古達(dá)拉特旗全年養(yǎng)殖季藻液各月24 h溫度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，7月藻液最高溫度為32.0 ℃，最低溫度為17.3 ℃，平均藻液溫度為25.2 ℃，為全年溫度最高月份；6和8月溫度差別不大，最高溫度分別為29.1和30.6 ℃，最低溫度分別為14.2和15.5 ℃，平均溫度則分別為22.2和23.6 ℃；5和9月藻液溫度相對(duì)較低，最高溫度分別為24.6和23.5 ℃，最低溫度分別僅為12.5和8.8 ℃，平均溫度分別為19.2和18.7 ℃。

全養(yǎng)殖季各月平均總輻射量如圖6所示。從圖6可以看出，5—7月平均總輻射量為22 MJ/(m2·d)，8月份平均總輻射量為19 MJ/(m2·d)，9月份平均總輻射量為17 MJ/(m2·d)；全年光照情況較好。

圖5　全年養(yǎng)殖中藻液溫度Fig.5　 Temperature of algae solution in whole year of culture

圖6　全年各月總輻射量Fig.6　Monthly total radiation in the whole year

對(duì)內(nèi)蒙古達(dá)拉特旗規(guī)?；B(yǎng)殖全年光照、平均藻液溫度及產(chǎn)量關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，當(dāng)溫度在17 ℃以下時(shí)，產(chǎn)量不會(huì)因?yàn)楣庹湛偰芰康脑黾佣岣?，生長(zhǎng)受溫度的影響較大，整體產(chǎn)量較低。當(dāng)溫度為17～27 ℃，產(chǎn)量主要受光照的控制，光照越強(qiáng)，產(chǎn)量越高。

圖7　微藻規(guī)模化養(yǎng)殖過程中溫度、光照與產(chǎn)量的關(guān)系Fig.7　Relationship between temperature,light and yield in large scale production of microalgae

規(guī)?；a(chǎn)各月ENN1001A EPA含量見圖8。從圖8可以看出，在5和9月時(shí)EPA含量分別為4.2%和4.6%，6和8月EPA含量均為3.9%，7月EPA含量降至最低(3.2%)，全養(yǎng)殖季EPA變化和藻液溫度變化一致，整體呈先下降后上升的變化趨勢(shì)。

圖8　不同月份ENN1001A EPA含量的變化 Fig.8　Content of EPA in ENN1001A algae in different months

藻粉中EPA含量和養(yǎng)殖季平均溫度關(guān)系見圖9。從圖9可以看出，在整個(gè)養(yǎng)殖季中EPA含量與藻液平均溫度密切相關(guān)，隨著藻液溫度的升高，EPA含量呈線性下降。

圖9　溫度與EPA含量的關(guān)系Fig.9　The relationship between temperature and EPA content

從圖10可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，EPA產(chǎn)量逐漸降低。EPA產(chǎn)量在5和9月分別為738和786 mg/(m2·d)，6和8月EPA產(chǎn)量分別為663和646 mg/(m2·d)，7月份EPA產(chǎn)量最低[495 mg/(m2·d)]，全年平均產(chǎn)量為666 mg/(m2·d)，全養(yǎng)殖季EPA變化和藻液溫度變化一致，整體上呈先下降后上升的變化趨勢(shì)。

圖10　養(yǎng)殖季各月份EPA日均產(chǎn)量的比較Fig.10　The comparison of EPA average daily yield in different months in the breeding season

3　討論與結(jié)論

3.1溫度對(duì)EPA生產(chǎn)的影響溫度是決定植物代謝過程速率的主要環(huán)境因子之一[5]。 微藻能夠適應(yīng)的溫度范圍較寬，但不同溫度對(duì)微藻生長(zhǎng)和脂肪酸含量的影響較大。微藻細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的積累與溫度呈負(fù)相關(guān)，并受光照的誘導(dǎo)，這2個(gè)因素在誘導(dǎo)特異的脂肪酸去飽和酶的表達(dá)和脂肪酸組成的改變方面具有協(xié)同性。這是由于低溫激活了細(xì)胞中△12去飽和酶和Ω-3去飽和酶的轉(zhuǎn)錄與翻譯，增加了細(xì)胞內(nèi)的酶量，使膜脂的去飽和作用得以加強(qiáng)，以維持細(xì)胞完成正常生理功能所需的生物膜的流動(dòng)性[6-9]。楊官品等[10]推測(cè)長(zhǎng)鏈脂肪酸有可能提高微藻適應(yīng)高溫環(huán)境的能力。研究表明，EPA的含量隨著溫度的升高而降低，但生物量的生產(chǎn)受光照、溫度的綜合影響較大，在整個(gè) EPA的生產(chǎn)過程中生物質(zhì)產(chǎn)量對(duì)EPA產(chǎn)量的影響較大。因此，在保證產(chǎn)量的同時(shí)，盡可能提高EPA含量，在光照時(shí)間段使藻液溫度處于適宜生長(zhǎng)的環(huán)境積累生物量，在弱光低溫的早晨和傍晚積累EPA。

3.2微藻養(yǎng)殖過程中的溫度控制微藻養(yǎng)殖大多數(shù)采用冷凝管、加熱管、噴淋、棚膜等方式進(jìn)行溫度控制[11]，上述方法建設(shè)和運(yùn)行成本較高，不利于規(guī)模化應(yīng)用，且操作繁瑣，影響混合和/或透光效果。該研究主要利用氣候干燥地區(qū)蒸發(fā)量和晝夜溫差大的自然條件，通過液位控制來實(shí)現(xiàn)規(guī)?；统杀鹃_放式養(yǎng)殖系統(tǒng)的溫度控制。

水體的熱量主要來自輻射熱、輻射熱量及其對(duì)水體溫度，根據(jù)公式Q吸收=Q輻射-Q蒸發(fā)-Q藻轉(zhuǎn)化-Q反射計(jì)算吸收熱量。在吸收同樣多的熱量的情況下，如果初始藻液溫度相同的條件下，藻液溫度的變化與養(yǎng)殖水體的質(zhì)量成反比；對(duì)單位面積水體而言，藻液溫度與養(yǎng)殖深度成反比，養(yǎng)殖深度越深，同樣條件下藻液溫度越低。因此，在確定當(dāng)?shù)卣舭l(fā)量、光照、微藻生長(zhǎng)情況下，可對(duì)溫度和液位進(jìn)行理論計(jì)算，獲得適宜的養(yǎng)殖深度，對(duì)實(shí)際養(yǎng)殖進(jìn)行指導(dǎo)。

3.3規(guī)?；a(chǎn)EPA原料室外培養(yǎng)時(shí)，溫度隨晝夜的更替和季節(jié)的變化產(chǎn)生較大的波動(dòng)，這與室內(nèi)培養(yǎng)的溫度條件有較大的差異。該研究發(fā)現(xiàn)，在規(guī)?；B(yǎng)殖過程中，EPA含量比實(shí)驗(yàn)室同等溫度下較高，這可能是由規(guī)?；B(yǎng)殖過程中晝夜溫差影響造成的。在養(yǎng)殖過程中，各月藻液最低溫度均低于20 ℃，有利于EPA的累積。大量研究表明，不同季節(jié)微藻細(xì)胞內(nèi)EPA的含量不同[12-13]。Sukenik等[14]研究了室外大規(guī)模培養(yǎng)微綠藻時(shí)，溫度的季節(jié)性波動(dòng)對(duì)脂肪酸種類的影響很大。冬季水溫在8～16 ℃ 時(shí)生物量產(chǎn)率較低，但EPA含量最高(占干重的3．8%)；在夏季，當(dāng)生物量產(chǎn)率最高時(shí)，EPA的含量降到不足冬季的50%。Zittelli等[15]報(bào)道春季和初秋EPA含量最高。這與該研究長(zhǎng)期養(yǎng)殖結(jié)果相一致。

目前規(guī)?；a(chǎn)EPA的很少，基本上都是基于研究室的探索性養(yǎng)殖，且以反應(yīng)器為主。Dunstan等[16]采用不同光徑的露天平板式反應(yīng)器培養(yǎng)擬微球藻，冬季和夏季EPA的最高產(chǎn)率分別為278.2和515．70 g/(m2·d)。

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