楊　楠　王　曦　郭曉瑞　劉　洋　唐中華　王洪政

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱　150040)

膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge.)及其變種蒙古黃芪(AstragalusmembranaceusBunge var.mongholicus(Bge.) Hsiao)屬于豆科(Leguminosae)植物，它們的干燥根是我國重要的中藥材，具有提高免疫功能、抗感染、抗氧化以及改善心血管功能等多種生理活性[1～3]。黃芪根中的主要藥用成分包括黃酮、皂苷和多糖三大類，其中黃酮主要為芒柄花素、毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷等[4]。目前，關(guān)于黃芪的資源培育和藥用理論方面的研究較多，但是對于其種子萌發(fā)生理的研究較為少見。

種子萌發(fā)是植物生活史的開始，萌發(fā)和萌發(fā)后生長的情況直接決定著植物形態(tài)建成以及成株的狀態(tài)[5]。已有研究表明，活性氧，特別是H2O2對植物種子萌發(fā)和萌發(fā)后生長具有明顯的調(diào)控作用[6～9]。早在吸脹階段，種子組織中即出現(xiàn)了明顯的H2O2及其它種類活性氧的累積[10]?；钚匝醯姆e累可以作為信號物質(zhì)調(diào)控植物的生長發(fā)育，但是過高的氧化水平會對植物本身造成了氧化脅迫，引起植物代謝障礙甚至細(xì)胞死亡[11～12]。因此，植物需要在萌發(fā)和萌發(fā)后生長過程中提高其體內(nèi)的抗氧化能力，以保證植物免于氧化脅迫。

黃酮作為天然的自由基清除劑與抗氧化劑，在植物抗氧化中具有重要作用。在擬南芥、大豆、鷹嘴豆和羽扇豆發(fā)芽過程中均發(fā)現(xiàn)了黃酮類化合物合成的增加[13～16]，暗示著黃酮類化合物可能在植物種子發(fā)芽過程中對提高其抗氧化能力做出了一定貢獻(xiàn)。本研究以膜莢黃芪和蒙古黃芪為實驗材料，通過對比研究它們在不同萌發(fā)和萌發(fā)后生長時期主要黃酮類活性成分含量以及關(guān)鍵合成酶基因表達(dá)的動態(tài)變化，以期揭示黃酮類化合物在黃芪萌發(fā)和萌發(fā)后生長中的生物合成變化規(guī)律以及它們可能發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge，以下簡稱A.membranaceus)和蒙古黃芪(AstragalusmembranaceusBunge var.mongholicus(Bge.) Hsiao，以下簡稱A.membranaceusvar.mongholicus)的種子均購自河北省安國市元泰藥用植物種子站。毛蕊異黃酮苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)、毛蕊異黃酮(Calycosin)和芒柄花素(Formononetin)標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。色譜級甲醇、乙腈購于北京百靈威化學(xué)有限公司，去離子水(電阻率高于18.2 MΩ·cm-1)取自Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，USA)，丙酮(分析純)購自天津富宇精細(xì)化工有限公司，碳酸鈣(分析純)購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1種子萌發(fā)及萌發(fā)后生長實驗

挑選飽滿健康的蒙古黃芪和膜莢黃芪種子，用10%次氯酸鈉浸泡15～20分鐘后用自來水和蒸餾水分別清洗4次。待種子在蒸餾水中于15℃黑暗環(huán)境中吸脹24 h后，將其播撒于鋪有3層用蒸餾水浸潤濾紙的15 cm培養(yǎng)皿中(150粒/皿)進(jìn)行發(fā)芽。環(huán)境條件為光照/黑暗14/10 h，恒溫25℃，72%濕度。實驗總共進(jìn)行9天，每天都播種新種子并從不同發(fā)芽時間的培養(yǎng)皿中選出具有代表性的種子進(jìn)行拍照。

1.2.2UPLC-MS黃酮含量測定

在實驗第9天，將發(fā)芽0～8天的種子或幼苗收獲后在液氮中研磨成粉。準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品粉末，加入20 mL 80%乙醇超聲輔助提取45 min，過濾后殘渣再加入20 mL溶劑提取一次，合并兩次提取液，在真空條件下濃縮至干。用1 mL色譜級甲醇復(fù)溶樣品，14 000 r·min-1離心10 min，上清液保存于-20℃?zhèn)溆茫瑯悠窚y定前用0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾。

色譜條件：超高效液相色譜系統(tǒng)(ACQUITY UPLC system,Waters,USA)；色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18Column(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為5 μL；流動相由水和乙腈組成，流速保持在0.25 mL·min-1，8%乙腈(0～1 min)→34%乙腈(1～1.5 min)→34%乙腈(1.5～4 min)→60%乙腈(4～6 min)→60%乙腈(6～7 min)→8%乙腈(7～7.5 min)→8%乙腈(7.5～9 min)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源噴霧電壓為5 500 V，離子源霧化溫度為500℃，霧化氣壓為25 psi，氣簾氣壓為20 psi。毛蕊異黃酮苷：m/z 446.9→284.2，去簇電壓104 V，碰撞電壓24 V，碰撞室射出電壓8 V；毛蕊異黃酮：m/z 285.0→269.9，去簇電壓117 V，碰撞電壓33 V，碰撞室射出電壓17 V；芒柄花素：m/z 269.0→196.2，去簇電壓80 V，碰撞電壓50 V，碰撞室射出電壓17 V。

1.2.3黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因的qRT-PCR分析

發(fā)芽0～8 d的種子或幼苗RNA的提取按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，Japan)說明書合成cDNA第一鏈。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，Japan)，反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution、2 μL模板cDNA、1 μL正義端引物、1 μL反義端引物以及超純水8.5 μL。黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因PAL(Genbank No.EF567076)、C4H(Genbank No.HQ339960)、CHS(Genbank No.JQ048940)、CHR(Genbank No.HM357239)、CHI(Genbank No.DQ205407)、IFS(Genbank No.JF912329)、I3’H(Genbank No.JQ609280)的特異性引物由Primer premier 5合成獲得[17]。此外，在NCBI上只有黃芪黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因4CL的部分片段UCGT(Genbank No.KF355973)。通過與其他4CL基因序列相似性比對，使用簡并引物獲得擴增片段[17]。使用的特異性引物見表1。PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s；56℃ 30 s；72℃ 30 s；35個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCT方法計算。

表1　RT-PCR引物設(shè)計

圖1　膜莢黃芪與蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長進(jìn)程Fig.1　The processes of germination and post-germination growth in A.membranaceus and A.membranaceus var. mongholicus

2　結(jié)果與分析

2.1　膜莢黃芪與蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長進(jìn)程

膜莢黃芪和蒙古黃芪在吸脹后0～8 d的形態(tài)見圖1。蒙古黃芪種子在吸脹后第2天出現(xiàn)了露白，第3天胚根突出種皮，隨后胚軸開始伸長，第5天種皮開始破裂，同時子葉變綠，第7天子葉伸開。膜莢黃芪種子萌發(fā)要明顯晚于蒙古黃芪，第3天開始種子才出現(xiàn)露白，第4天胚根突出種皮，第8天子葉脫離種皮并變綠。根據(jù)植物種子發(fā)芽的定義，對蒙古黃芪來說，0～2天為萌發(fā)階段，3～8天為萌發(fā)后生長階段；對膜莢黃芪而言，0～4天為萌發(fā)階段，5～8天為萌發(fā)后生長階段。

2.2　膜莢黃芪與蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長過程中主要黃酮類化合物含量的變化

吸脹后，膜莢黃芪和蒙古黃芪種子中毛蕊異黃酮的含量均明顯高于毛蕊異黃酮苷和芒柄花素(表2)，說明毛蕊異黃酮是它們中最主要的黃酮種類。當(dāng)兩種種子進(jìn)行比較時，膜莢黃芪中毛蕊異黃酮的含量明顯高于蒙古黃芪，而芒柄花素含量則明顯低于蒙古黃芪。

表2膜莢黃芪和蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長過程中主要黃酮類化合物含量

Table2Contentvariationofthemajorflavonoidsduringgerminationandpost-germinationgrowthinA.membranaceusandA.membranaceusvar.mongholicus

種子吸脹后天數(shù)Daysafterimbibitionofseed毛蕊異黃酮苷含量Calycosin-7-O-β-D-glucosidecontent(μg·g-1)毛蕊異黃酮含量Calycosincontent(μg·g-1)芒柄花素含量Formononetincontent(μg·g-1)膜莢黃芪A.membranaceus蒙古黃芪A.membranaceusvar.mongholicus膜莢黃芪A.membranaceus蒙古黃芪A.membranaceusvar.mongholicus膜莢黃芪A.membranaceus蒙古黃芪A.membranaceusvar.mongholicus00.0043±0.0010*0.0045±0.00100.0872±0.00300.0549±0.00200.0054±0.00020.0091±0.000210.0040±0.00300.0043±0.00300.0852±0.00300.0529±0.00300.0054±0.00020.0090±0.000320.0083±0.00100.0206±0.00100.1846±0.01000.0861±0.00500.0042±0.00010.0147±0.000530.0020±0.00300.0637±0.00300.0346±0.00300.0974±0.00300.0042±0.00010.0130±0.000340.0218±0.00410.0580±0.00410.0130±0.00110.0559±0.00410.0132±0.00040.0072±0.000150.0068±0.00400.0546±0.00400.0572±0.00400.0479±0.00400.0200±0.00050.0099±0.000260.0222±0.00300.2542±0.01000.0109±0.00200.0428±0.01000.0131±0.00040.0042±0.000170.0478±0.00430.3406±0.01930.0960±0.00430.0108±0.00430.0266±0.00040.0041±0.000480.0853±0.00500.1678±0.01500.0483±0.00200.0268±0.00200.0151±0.00030.0043±0.0002

注：*采用以干物質(zhì)為基礎(chǔ)的3次測定值的平均值和誤差值來表示。

Note:*mean and error values are expressed on a dry matter basis for the three measurements.

隨著膜莢黃芪種子萌發(fā)的開始，毛蕊異黃酮苷和芒柄花素的含量出現(xiàn)了明顯升高，分別比吸脹后升高了407%和144%，而毛蕊異黃酮的含量則出現(xiàn)了顯著降低，僅為吸脹后的15%。在蒙古黃芪中，發(fā)芽當(dāng)天3種黃酮含量則都出現(xiàn)了明顯升高。

進(jìn)入萌發(fā)后生長過程，膜莢黃芪中毛蕊異黃酮苷的含量出現(xiàn)連續(xù)的升高并在第8天達(dá)到最高值，毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量則出現(xiàn)了震蕩性的變化，它們同時在第5和7天出現(xiàn)震蕩高峰。在蒙古黃芪中，毛蕊異黃酮苷含量也出現(xiàn)了明顯的連續(xù)升高，但是它在第7天達(dá)到頂點后在第8天出現(xiàn)顯著的降低，毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量則出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，其中毛蕊異黃酮下降的幅度大于芒柄花素。

此外，從3種黃酮總量來看，吸脹后膜莢黃芪中的含量稍高于蒙古黃芪(圖2)。在種子萌發(fā)和萌發(fā)后生長過程中，黃酮總量在兩種黃芪中均出現(xiàn)了雙峰式變化。在膜莢黃芪中，黃酮總量分別在第2天和第7天達(dá)到峰值，兩個峰值大小相近。在蒙古黃芪中，兩個峰值則分別出現(xiàn)在第3天和第7天，并且第7天的峰值明顯大于第3天。同時，在蒙古黃芪種子萌發(fā)階段，它所含3種黃酮總量低于膜莢黃芪，但是進(jìn)入萌發(fā)后生長過程后，其所含3種黃酮的總量則明顯高于膜莢黃芪。

圖2　膜莢黃芪與蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長過程中3種主要黃酮總量的變化　所有實驗進(jìn)行了3次重復(fù)，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。下同。Fig.2　The total contents of the three flavonoids in during germination and post-germination growth in A.membranaceus and A.membranaceus var. mongholicusAll experiments were performed in triplicate, and error bars represent SE.The same as below.

2.3　膜莢黃芪與蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長過程中主要黃酮類化合物生物合成途徑酶基因表達(dá)情況的變化

膜莢黃芪中，吸脹后種子中PAL、C4H和4CL基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量明顯高于蒙古黃芪，CHS、CHR和IFS的表達(dá)量則明顯低于蒙古黃芪(圖3)。在種子發(fā)芽前，膜莢黃芪種子中除C4H外，其它途徑酶基因的表達(dá)量均在第3天出現(xiàn)了明顯的升高，而在發(fā)芽當(dāng)天又都顯著降低。在隨后的萌發(fā)后生長過程中，PAL、C4H、4CL、CHS、CHR和IFS的表達(dá)量又比發(fā)芽當(dāng)天小幅升高。此外，膜莢黃芪中我們檢測的所有途徑酶基因都在第8天達(dá)到了最大表達(dá)量，分別為吸脹后的2～3倍。

圖3　膜莢黃芪與蒙古黃芪萌發(fā)及萌發(fā)后生長過程中主要黃酮類化合物生物合成途徑酶基因表達(dá)情況Fig.3　The expression of enzymes in flavonoid synthesis pathway during germination and post-germination growth in A.membranaceus and A.membranaceus var. mongholicus

在蒙古黃芪種子萌發(fā)過程中，PAL、4CL、CHR、CHI和I3’H基因表達(dá)量都沒有出現(xiàn)較大變化，C4H和CHS表達(dá)分別在露白和發(fā)芽當(dāng)日出現(xiàn)明顯升高，而IFS表達(dá)則在露白當(dāng)日出現(xiàn)了明顯降低。萌發(fā)后生長過程中，所有途徑酶的表達(dá)量在第4天都出現(xiàn)了大幅度升高，特別是PAL、CHI和I3’H基因，它們在第4天的表達(dá)量分別達(dá)到了吸脹后的3.3、11.5和10.4倍。隨后，所有途徑酶的表達(dá)量在第6天下降到等于或低于吸脹后的水平后，C4H、4CL、CHS、CHR和IFS表達(dá)量在第7～8天又出現(xiàn)了連續(xù)升高，而PAL、CHI和I3’H表達(dá)量則在第7天升高后第8天下降。

同時，從整個萌發(fā)和萌發(fā)后生長階段來看，蒙古黃芪中主要黃酮合成途徑酶基因的表達(dá)水平總體高于膜莢黃芪，這種情況在萌發(fā)后生長中尤為突出。

3　討論

植物種子的萌發(fā)過程開始于種子吸脹，結(jié)束于胚軸突破種皮等周圍結(jié)構(gòu)并明顯伸出[15]。根據(jù)此發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)吸脹后膜莢黃芪和蒙古黃芪種子的萌發(fā)時間分別為4和2天。其中，膜莢黃芪開始萌發(fā)的時間與段琦梅等的結(jié)果相一致[16]，而蒙古黃芪開始萌發(fā)的時間則稍長于李景欣等的實驗結(jié)果，在他們的實驗中第1天種子發(fā)芽率已經(jīng)達(dá)到了14%[18]，這可能與所使用種子的休眠狀況不同有關(guān)系。除了種皮堅硬引起的黃芪種子休眠外[19]，黃芪種子中還存在內(nèi)源發(fā)芽抑制物質(zhì)，蒙古黃芪種子的水浸液對黨參種子的萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的抑制做作用[20]。此外，在早前使用上一年新收蒙古黃芪種子進(jìn)行萌發(fā)的研究中，發(fā)現(xiàn)不經(jīng)去種皮處理的種子在吸脹后第4天才開始萌發(fā)[21]。

活性氧與脫落酸和赤霉素一起參與了植物種子萌發(fā)的調(diào)控。外源H2O2浸種處理后引起了大麥種子內(nèi)源ABA含量的降低，并且促進(jìn)了種子的萌發(fā)[22]。同時，在種子吸脹階段，隨著種子含水量的逐漸升高，活性氧的含量出現(xiàn)爆發(fā)式增長，這對于打破種子休眠、促進(jìn)種子發(fā)芽和萌發(fā)后生長以及松弛細(xì)胞壁具有重要作用[23～25]。但是，種子內(nèi)的活性氧必須被控制在一定水平，以免對種子細(xì)胞造成傷害，因此種子在萌發(fā)過程中需要抗氧化系統(tǒng)來清除多余的活性氧，這對于種子萌發(fā)的成功至關(guān)重要[26～28]。在我們的實驗中，膜莢黃芪和蒙古黃芪種子在萌發(fā)過程中3種主要黃酮含量及其總量在吸脹后2天都出現(xiàn)了明顯的升高。黃酮類化合物作為高效的天然抗氧化劑已經(jīng)廣為人知，因此推測其含量升高可能在提高種子抗氧化能力上發(fā)揮了一定作用。

在植物中，黃酮類化合物的生物合成受多種環(huán)境因子的調(diào)控，包括光照在內(nèi)[29～31]。本研究中兩種黃芪種子是在光照條件下進(jìn)行萌發(fā)和萌發(fā)后生長的，種子萌發(fā)后上胚軸和子葉在接受光照后變綠。我們發(fā)現(xiàn)膜莢黃芪和蒙古黃芪在各自種子萌發(fā)后1天(下胚軸伸出變綠)以及子葉伸出種皮時均出現(xiàn)了較高的黃酮類化合物積累，說明在黃芪種子萌發(fā)后生長過程中光照促進(jìn)了黃酮類化合物的生物合成。

黃芪中的黃酮類化合物來源于苯丙烷類代謝途徑。首先，苯丙氨酸經(jīng)PAL、C4H和4CL依次催化被轉(zhuǎn)化為4-香豆酸-CoA，隨后在CHS的催化作用下將苯丙烷類代謝引入到黃酮類化合物的合成方向[32～33]。CHI在黃芪黃酮類化合物生物合成中起到重要作用，因為它催化了查爾酮轉(zhuǎn)化為黃烷酮的反應(yīng)[33～34]。IFS和I3’H則分別催化了黃芪黃酮類化合物前體物質(zhì)大豆黃素的合成以及芒柄花素向毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)化。在我們的研究中，蒙古黃芪種子萌發(fā)過程中PAL、C4H、4CL和CHS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)均明顯升高，下游基因表達(dá)則未出現(xiàn)明顯變化甚至有所降低，說明蒙古黃芪萌發(fā)中主要通過上調(diào)上游途徑來增加黃酮類物質(zhì)的合成。與蒙古黃芪不同，除C4H外，膜莢黃芪中所有途徑酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均在發(fā)芽前1天發(fā)生了大幅度升高，表明上游和下游途徑均參與了膜莢黃芪種子萌發(fā)黃酮類物質(zhì)的積累。此外，在實驗第4天蒙古黃芪中所有途徑酶基因的表達(dá)均出現(xiàn)明顯升高，但是同一時間黃酮類物質(zhì)的積累并沒有出現(xiàn)明顯增加，直到第6天才出現(xiàn)較大幅度的增加，暗示這一時期途徑酶基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)與黃酮類物質(zhì)合成變化之間似乎存在一定時間的延遲。不過，當(dāng)?shù)?天蒙古黃芪中毛蕊異黃酮苷和3種黃酮總量得到峰值時，所有途徑酶的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯升高，表明不同生長階段黃酮類化合物的合成與途徑酶表達(dá)水平之間的時間關(guān)系十分復(fù)雜。同時，我們發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象也存在于膜莢黃芪中。在第5天，膜莢黃芪中幾乎所有途徑酶基因表達(dá)出現(xiàn)了明顯升高，同一時間毛蕊異黃酮、芒柄花素以及3種黃酮總量也都顯著增加，但是當(dāng)?shù)?天途徑酶基因表達(dá)再次升高時，除毛蕊異黃酮苷外，其它兩種黃酮含量均出現(xiàn)下降。

綜上所述，膜莢黃芪和蒙古黃芪中種子萌發(fā)以及萌發(fā)后生長中的光照都誘導(dǎo)了3種主要黃酮類化合物的積累。途徑合成酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平對其含量變化具有重要的調(diào)控作用，這種調(diào)控作用在兩種黃芪萌發(fā)過程中存在不同的模式，并且萌發(fā)后生長中選擇性地存在較為復(fù)雜的時間延遲效應(yīng)。

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