劉海瑞　高慶波　張發(fā)起　邢　?！∵t曉峰　陳世龍*

(1.中國(guó)科學(xué)院高原生物進(jìn)化與適應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧　810008； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京　100039)

莛子藨(TriosteumpinnatifidumMaxim.)又名羽裂葉莛子藨，隸屬于忍冬科(Caprifoliaceae)莛子藨屬(Triosteum)，多年生草本，分布于中國(guó)的河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、青海、河南、湖北和四川以及日本，為東亞特有種。生于海拔1 800～2 900 m的山坡暗針葉林下和溝邊向陽(yáng)處[1]。莛子藨的根、葉、果實(shí)均可入藥，具有一定藥用價(jià)值；味苦、澀、性平；祛風(fēng)除濕，行氣活血，消食；主治風(fēng)濕性腰腿痛，勞傷，跌打損傷，月經(jīng)不調(diào)，白帶，食積等[2]。目前對(duì)莛子藨的研究主要集中在化學(xué)成分[3～5]、形態(tài)組織學(xué)[6]方面，應(yīng)用葉綠體基因片段對(duì)其分子遺傳多樣性和譜系地理結(jié)構(gòu)的研究尚屬首次。

植物分子水平上的遺傳多態(tài)性直接反映為分子標(biāo)記多態(tài)性。上世紀(jì)70年代RFLP分子標(biāo)記技術(shù)的問(wèn)世，開(kāi)創(chuàng)了直接檢測(cè)和利用DNA分子的多型性。特別是80年代PCR技術(shù)的誕生，使得體外直接擴(kuò)增DNA的多態(tài)性成為可能。基于這一技術(shù)發(fā)明的創(chuàng)新性和它在應(yīng)用上的廣泛性，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，目前已經(jīng)發(fā)展了多種基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增(SSR)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用在系統(tǒng)進(jìn)化、品種鑒定及品種選育、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、分子育種及雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上，通過(guò)比較擴(kuò)增序列間差異為原理的的DNA測(cè)序技術(shù)極大地提高了分子標(biāo)記分析效率。常用的序列標(biāo)記主要來(lái)自于3個(gè)基因組系統(tǒng)，分別是核基因組(nuclear DNA,nDNA)、線(xiàn)粒體基因組(mitochondrial DNA,mtDNA)和葉綠體基因組(chloroplast DNA,cpDNA)。3個(gè)基因組的大小、起源及進(jìn)化機(jī)制不同，進(jìn)化速率差別也很大[7]。葉綠體DNA(cpDNA)多數(shù)具有單親遺傳的特性，在植物中大多數(shù)情況下為母系遺傳。擁有獨(dú)立的進(jìn)化路線(xiàn)，從而能更準(zhǔn)確的反應(yīng)出一系列的歷史事件所遺留的印記。不同的cpDNA片段進(jìn)化速率不同：其中，編碼區(qū)的核苷酸變異較低，適合較高分類(lèi)水平的系統(tǒng)發(fā)育研究；而非編碼區(qū)的變異率較高，適用于低分類(lèi)類(lèi)群和種內(nèi)的系統(tǒng)學(xué)研究。

譜系地理學(xué)(phylogeography)最早由Avise于1987年提出，與傳統(tǒng)的生物地理學(xué)相比，譜系地理學(xué)不僅僅局限于解釋現(xiàn)有居群的分布狀況，而是更深入的探究居群形成現(xiàn)有分布格局的歷史成因，闡述其進(jìn)化歷程，分析區(qū)域類(lèi)群在時(shí)間和空間尺度上的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而重建生物區(qū)系的歷史[8～11]。對(duì)單個(gè)物種的譜系地理學(xué)研究，往往關(guān)注該物種冰期避難所及在氣候變化過(guò)程中物種范圍的變化等進(jìn)化歷史問(wèn)題。本研究應(yīng)用cpDNA間隔區(qū)片段(intergenic regions)rbcL-accD作為分子標(biāo)記，研究莛子藨物種水平上的分子遺傳多樣性，并結(jié)合地理分布初步探討其譜系地理結(jié)構(gòu)及可能成因。

1　材料與方法

1.1　材料

本研究所用樣品于2008～2017年分別采自四川、青海、山西、陜西四省，共采集12個(gè)居群92個(gè)個(gè)體，每個(gè)居群內(nèi)采集3～15株植株葉片，采集的植株相距10 m以上，新鮮葉片用變色硅膠快速干燥保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。取樣信息見(jiàn)表1。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測(cè)

依據(jù)改良的CTAB法從硅膠干燥的葉片中提取總DNA[12]。通過(guò)DNA濃度分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA完整性。

1.2.2PCR擴(kuò)增與DNA測(cè)序

采用通用引物“rbcL”(5′-TAGCTGCTGCTTGTGAGGTATGGA-3′)和“accD”(5′-AAATACTAGGCCCACTAAAGG-3′)擴(kuò)增cpDNA rbcL-accD序列。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler pro SPCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含0.6 μL濃度約20 ng·μL-1的模板DNA、2.5 μL 10×PCR buffer(含Mg2+)、1.0 μL 10 mmol·L-1dNTPs、各0.5 μL 5 pM的雙向引物、0.2 μL (1.5單位)Taq聚合酶(中國(guó)大連Takara)、19.7 μL雙蒸水。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min;35個(gè)循環(huán):95℃變性50 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min;最后72℃延伸6 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

表1　莛子藨居群采樣信息表及單倍型分布

1.3　數(shù)據(jù)處理

序列用Clustal X軟件進(jìn)行排序比對(duì)[13]加以手工校對(duì)。用MEGA 5.1計(jì)算序列堿基A、T、C、G含量及轉(zhuǎn)換顛換比率。運(yùn)用DnaSP軟件[14]統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)和單倍型,并計(jì)算核苷酸多樣性(π)、單倍型多態(tài)性(h)。歧點(diǎn)分布(Mismatch distribution)分析也在Dnasp軟件中完成。Arlequin 3.11進(jìn)行分子變異分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)，分別得出多態(tài)性在居群間和居群內(nèi)的分布情況、FST值，并根據(jù)公式Nm=(1-FST)/4FST求出基因流。Tajima’s D和Fu’s Fs兩種無(wú)限突變位點(diǎn)模型的中性檢驗(yàn)方法分析也在Arlequin 3.11中進(jìn)行。利用PERMUT軟件計(jì)算居群內(nèi)平均遺傳多樣性(average gene diversity within populations，HS)、總的遺傳多樣性(total gene diversity，HT)、居群間遺傳分化系數(shù)GST(coefficient of gene differentiation)[15]和NST值[16]。使用U-統(tǒng)計(jì)方法對(duì)GST和NST進(jìn)行比較(1 000次重復(fù)的置換檢驗(yàn))。利用這些計(jì)算值可以檢驗(yàn)單倍型變異的地理分布模式，當(dāng)NST明顯大于GST時(shí)(P<0.05)，表示在同一區(qū)域親緣關(guān)系相近的單倍型發(fā)生于同一居群中，并且存在著明顯的分子系統(tǒng)地理學(xué)關(guān)系[17]。

以毛花忍冬(Loniceratrichosantha)為外類(lèi)群，應(yīng)用MrBayes3.2軟件構(gòu)建貝葉斯演化樹(shù)，以隨機(jī)樹(shù)為起始樹(shù)，每隔100代采樣一次，共運(yùn)行1 000 000代，棄去最開(kāi)始25%的預(yù)熱樹(shù)，剩余的樹(shù)用來(lái)計(jì)算一致樹(shù)和各分支的后驗(yàn)概率。在構(gòu)建貝葉斯樹(shù)之前先通過(guò)MrModeltest 2.3檢測(cè)最優(yōu)核苷酸替代模型(substitution model)[18]。

2　結(jié)果與分析

2.1　序列及單倍型分析

圖1　莛子藨rbcL-accD序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoretogram of PCR production of rbcL-accD sequence

基于5處變異位點(diǎn)，DnaSP共檢測(cè)出6個(gè)單倍型(H1-H6)。單倍型H2出現(xiàn)在除P7、P10、P12之外的9個(gè)居群中，分布最廣泛；單倍型H3(P10，陜西太白山)、H4(P10，陜西太白山)、H5(P10，四川紅原)、H6(P5，青海平安)為特有單倍型，分別只在一個(gè)居群中分布，分布范圍窄、出現(xiàn)頻率低(表1)。

2.2　莛子藨cpDNA rbcL-accD序列遺傳多樣性及動(dòng)態(tài)歷史分析

莛子藨cpDNArbcL-accD序列12個(gè)居群的單倍型多樣性(Hd)范圍從0～0.600，整體水平為0.409 2，核苷酸多樣性(π)范圍從0到0.002 38，整體水平為0.000 67，P10的單倍型多樣性和核苷酸多樣性最高，分別為0.600和0.002 38。AMOVA分析顯示27.72%的多態(tài)性來(lái)自居群內(nèi)，居群間的多態(tài)性占72.28%，表明莛子藨的遺傳變異主要存在于居群間，居群間具有較高的分化水平。

基于莛子藨cpDNArbcL-accD序列的6種單倍型用PERMUT軟件計(jì)算結(jié)果表明，居群內(nèi)平均遺傳多樣性(HS)為0.139，總的遺傳多樣性(HT)為0.597，居群間遺傳分化GST和NST分別為0.767和0.764。使用U統(tǒng)計(jì)方法(1000重復(fù)檢驗(yàn))對(duì)整個(gè)分布區(qū)單倍型變異的地理分布模式進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果為NST

2.3　種群動(dòng)態(tài)歷史

在物種水平上對(duì)rbcL-accD序列進(jìn)行失配分析，得到單峰曲線(xiàn)(圖2)，符合近期擴(kuò)張模型的假設(shè)，同時(shí)中性檢驗(yàn)值Tajima’s D和Fu’s Fs分別為-1.037 4(P>0.05)、-2.576 1(P>0.05)，表明莛子藨種群經(jīng)歷了不顯著的種群選擇或者擴(kuò)張事件。

圖2　莛子藨居群采樣點(diǎn)及rbcL-accD序列單倍型分布圖Fig.2　Geographic distribution of cpDNA haplotypes detected among 12 populations of T.pinnatifidum　Pie charts show the proportions of haplotypes within each population

2.4　系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)rbcL-accD序列單倍型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建得到的貝葉斯樹(shù)(圖3)顯示各分支都得到了較高的后驗(yàn)支持率，其中單倍型H1自成一支，其余單倍型聚為一支。其中單倍型H4、H5又聚為小的分支，表明雖然H4(P10，陜西太白山)、H5(P7，四川紅原)分布在距離較遠(yuǎn)的不同居群，但具有較近的親緣關(guān)系。

圖3　莛子藨所有個(gè)體的葉綠體基因片段rbcL-accD序列數(shù)據(jù)的歧點(diǎn)分布Fig.3　Mismatch distribution for chloroplast DNA sequence data of T.pinnatifidum　Solid lines represent expected differences among sequences,whereas dashed lines are drawn from the observed differences.

圖4　葉綠體DNA rbcL-accD 6個(gè)單倍型構(gòu)建貝葉斯樹(shù)，分支上的數(shù)字分別表示貝葉斯后驗(yàn)概率(BPP)Fig.4　Phylogenetic relationships inferred among the haplotypes of T.pinnatifidum based on the sequences of cpDNA from Bayesian inference　Posterior probabilities given at the nodes

3　討論

近年來(lái)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和序列信息被廣泛應(yīng)用于揭示物種起源、進(jìn)化演變及不同物種之間的親緣關(guān)系和同一物種不同居群間的分化等方面[19～21]。主要原因如下：首先，植物基因組因其結(jié)構(gòu)和功能上的差異,進(jìn)化速率也有所不同?？偟膩?lái)說(shuō),核基因組進(jìn)化最快,約為葉綠體基因組的2倍;線(xiàn)粒體基因組進(jìn)化最慢,還不到葉綠體基因組的1/3[19]；其次，cpDNA為單性遺傳,有獨(dú)立的進(jìn)化路線(xiàn),不依賴(lài)于其它任何數(shù)據(jù)即可構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù),可為從歷史和系統(tǒng)發(fā)育的角度解釋生物多樣性提供可靠和準(zhǔn)確的信息[22]。第三，葉綠體基因序列編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列進(jìn)化速率相差較大,可適于不同分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育研究[23]。本研究中，葉綠體DNA基因間隔序列rbcL-accD提供了足夠的位點(diǎn)信息，能夠在一定程度上揭示莛子藨居群間的進(jìn)化關(guān)系。所以cpDNA序列rbcL-accD可以用于莛子藨屬植物的分子譜系地理學(xué)研究。

莛子藨cpDNA序列rbcL-accD序列檢測(cè)結(jié)果顯示在序列的5處變異位點(diǎn)中，不存在片段的插入或者缺失，全部為點(diǎn)突變(表2)，這說(shuō)明該地區(qū)物種序列分化水平較低?；趓bcL-accD序列單倍型的AMOVA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因多態(tài)性大部分來(lái)源于居群間，表現(xiàn)出較高的居群間遺傳變異水平。葉綠體DNA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示被子植物的居群間的總的遺傳多樣性HT=0.660[24]，而莛子藨的居群間總的遺傳多樣性(HT=0.597)非常接近被子植物的平均值，但居群內(nèi)的平均遺傳多樣性則較低(HS=0.139)，我們認(rèn)為青藏高原東北部邊緣及其鄰近高山地區(qū)復(fù)雜多樣的地形、不同區(qū)域之間氣候環(huán)境異質(zhì)性為莛子藨提供了適宜的生境，保持了該物種的遺傳多樣性。本研究中莛子藨基因流Nm(0.096)<1,基因交流程度較低，因而居群之間的遺傳變異大。所以，造成莛子藨cpDNA序列rbcL-accD多樣性水平低而居群間分化水平高的原因可能為以下兩點(diǎn)：首先居群內(nèi)采樣數(shù)量少，致使居群沒(méi)有表現(xiàn)出所有單倍型；其次由于地理隔離和環(huán)境因素的影響使得莛子藨生境出現(xiàn)片段化，致使便于基因交流或者生境相似的居群出現(xiàn)相同或者關(guān)系相近的單倍型(P1/P2/P3/P4/P5/P6等)，而基因交流被隔離或者生境差異較大的居群間表現(xiàn)出明顯的遺傳分化(如P10/P11/P12等)。

表2莛子藨葉綠體DNArbcL-accD片段6種單倍型間的序列變異位點(diǎn)

Table2VariablesitesofcpDNAhaplotypesofT.pinnatifidum

單倍型Haplotypes變異位點(diǎn)Variablesites384404438601613總數(shù)TotalH1AAAAT10H2.TG..71H3.T.T.2H4.T...3H5GT...3H6GT..A4

基于cpDNA序列進(jìn)行的失配分析單峰結(jié)果符合近期擴(kuò)張模型，中性檢驗(yàn)結(jié)果Tajima’s D和Fu’s Fs也支持莛子藨經(jīng)歷了種群選擇或者擴(kuò)張事件。由于該區(qū)域的莛子藨優(yōu)勢(shì)單倍型(H2)分布廣泛，特有單倍型(H3、H4、H5、H6)分布在距離較遠(yuǎn)的居群中，綜合分析結(jié)果，我們推測(cè)莛子藨在冰期存在多個(gè)避難所，間冰期或者冰期后從多個(gè)避難所中向外擴(kuò)張。避難所的具體位置及擴(kuò)散路線(xiàn)的確定還需要更大的樣本量、更廣的采樣范圍以及更多的基因標(biāo)記才能進(jìn)一步的研究推論。

1.中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志:第39卷[M].北京:科學(xué)出版社,1988.

Editorial Board of Flora of China.Flora of China[M].Beijing:Science Press,1988.

2.宋立人.中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999.

Song L R.Chinese herbal medicine[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1999.

3.趙澤青,蘇艷芳,黃雄.莛子藨地上部分1個(gè)新的環(huán)烯醚萜[J].中草藥,2016,47(8):1265-1268.

Zhao Z Q,Su Y F,Huang X.One new iridoid from aerial parts ofTriosteumpinnatifidum[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2016,47(8):1265-1268.

4.Chai X,Su Y F,Zheng Y H,et al.Iridoids from the roots ofTriosteumpinnatifidum[J].Biochemical Systematics and Ecology,2010,38(2):210-212.

5.周春東.白果七化學(xué)成分研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2010.

Zhou C D.Chemical constituents fromTriosteumpinnatifidumMaxim[D].Yangling:Northwest Agriculture and Forestry University,2010.

6.曹丹,李濤,伍龍,等.莛子藨的形態(tài)組織學(xué)研究[J].華西藥學(xué)雜志,2014,29(1):56-58.

Cao D,Li T,Wu L,et al.Study on the morphology and histology ofTriosteumpinnatifidum[J].West China Journal of Pharmaceutical Sciences,2014,29(1):56-58.

7.Wolfe K H,Li W H,Sharp P M.Rates of nucleotide subst itution vary greatly among plant mitochondrial,chloroplast,and nuclear DNAs[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1987,84(24):9054-9058.

8.Avise J C,Arnold J,Ball R M,et al.Intraspecific phylogeography:the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics[J].Annual Review of Ecology and Systematics,1987,18:489-522.

9.Avise J C.Phylogeography:retrospect and prospect[J].Journal of Biogeography,2009,36(1):3-15.

10.Hewitt G M.Speciation,hybrid zones and phylogeography-or seeing genes in space and time[J].Molecular Ecology,2001,10(3):537-549.

11.Hewitt G M.Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary[J].Philosophical Transactions of the Royal Society of London.Series B:Biological Sciences,2004,359(1442):183-195.

12.Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin,1987,19:11-15.

13.Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F,et al.The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research,1997,25(24):4876-4882.

14.Librado P,Rozas J.DnaSP v5:a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics Applications Note,2009,25(11):1451-1452.

15.Nei M.Molecular evolutionary genetics[M].New York:Columbia University Press,1987.

16.Grivet D,Petit R J.Phylogeography of the common ivy(Hederasp.) in Europe:genetic differentiation through space and time[J].Molecular Ecology,2002,11(8):1351-1362.

17.Pons O,Petit R J.Measwring and testing genetic differentiation with ordered versus unordered alleles[J].Genetics,1996,144(3):1237-1245.

18.Nylander J A A.MrModeltest v2.Program distributed by the author[R].Norbyv?gen:Evolutionary Biology Centre,Uppsala University,2004.

19.邢少辰,Clarke Jihong Liu.葉綠體基因組研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008,35(1):21-28.

Xing S C,Liu C J.Progress in chloroplast genome analysis[J].Progress in Biochemistry and Biophysics,2008,35(1):21-28.

20.段義忠,張得鈞,高慶波,等.窄葉鮮卑花(Sibiraeaangustata)nrDNA ITS和cpDNAtrnL-F序列分子進(jìn)化特點(diǎn)的分析[J].植物研究,2010,30(2):146-151.

Duan Y Z,Zhang D J,Gao Q B,et al.Characteristic of molecular evolution ofSibiraeaangustataBased on nrDNA ITS and cpDNAtrnL-F sequence analysis[J].Bulletin of Botanical Research,2010,30(2):146-151.

21.楊路存,劉何春,周學(xué)麗,等.羌活(Notopterygiumincisum)nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12序列分子進(jìn)化特點(diǎn)的分析[J].植物研究,2016,36(2):291-296.

Yang L C,Liu H C,Zhou X L,et al.Characteristic of molecular evolution ofNotopterygiumincisumBased on nrDNAITS and cpDNA rpl20-rps12 sequence analysis[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(2):291-296.

22.曹慶芹,甄貞,姜潔,等.葉綠體DNA分析技術(shù)及其在栗屬植物中的應(yīng)用[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2008,25(3):396-399.

Cao Q Q,Zhen Z,Jiang J,et al.Chloroplast DNA analysis technology and its application inCastanea[J].Journal of Fruit Science,2008,25(3):396-399.

23.田欣,李德銖.DNA序列在植物系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].云南植物研究,2002,24(2):170-184.

Tian X,Li D Z.Application of DNA sequences in plant phylogenetic study[J].Acta Botanica Yunnanica,2002,24(2):170-184.

24.Magni C R,Ducousso A,Caron H,et al.Chloroplast DNA variation ofQuercusrubraL.in North America and comparison with other Fagaceae[J].Molecular Ecology,2005,14(2):513-524.