葛曉蘭　劉彩霞　張鑫鑫　李　瑩　曲冠證

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150040)

環(huán)境條件的變化對植物生物量的生產(chǎn)和生長分布存在影響[1]，植物的非生物脅迫是指不適宜生長的環(huán)境條件，非生物脅迫包括干旱、鹽堿等占影響作物減產(chǎn)原因的50%[2～3]，主要是由于這些非生物脅迫對植物施加滲透壓脅迫，使離子不平衡造成內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂，最終導(dǎo)致生長受到抑制[4]。然而主要限制作物分布和產(chǎn)量的環(huán)境因素為作物生長土壤中的鹽堿濃度[5～6]。土壤的鹽堿化不僅危害作物賴以生存的土壤條件，而且禍及作物的生長，造成作物缺苗或死亡，從而阻礙農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，土壤鹽堿化是當(dāng)?shù)匕l(fā)展農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要限制因素。鹽脅迫主要是指在高鹽環(huán)境下植物的生長受到抑制或受到一定損傷[7]。堿脅迫主要指土壤中NaHCO3和Na2CO3積累過多導(dǎo)致土壤呈堿性，影響植物正常生長[8～9]。隨著分子生物學(xué)越來越廣泛的應(yīng)用于抗逆研究中，其對于鹽脅迫應(yīng)答基因的研究就有了很大的進(jìn)步[13]，主要成績集中于啟動子和轉(zhuǎn)錄因子上。但仍面臨兩個問題：一是，到目前為止研究的或是確定的耐鹽基因都僅在自身物種中表達(dá)；二是，許多耐鹽基因在其他物種中過表達(dá)會在鹽脅迫下表現(xiàn)出不耐受性。Guo L Q等研究發(fā)現(xiàn)植物在中性鹽和堿性鹽的脅迫下存在明顯差異，無論是其作用機(jī)制還是植物生理反應(yīng)[14]，鹽堿度的主要影響其中就包括脂質(zhì)的過氧化和由活性氧(ROS)引起的膜完整性損失，導(dǎo)致代謝紊亂，可通過測定MDA(丙二醛)的含量推測植物受損傷程度[10～12]。因此了解植物如何應(yīng)對這些脅迫對提高植物抗性是至關(guān)重要的[13,15]。

未知功能結(jié)構(gòu)域(Domain of unknown function以下簡稱DUF)是一種沒有特征功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其命名方式是由Chris Ponting向SMART數(shù)據(jù)庫提交DUF1和DUF2時引入的[16]，目前在Pfam數(shù)據(jù)庫中有超過3 000個DUF家族存在[17]。許多DUF表現(xiàn)出高度保守性，這表明其在生物中還是有重要作用的。本實(shí)驗(yàn)將對檉柳中得到的DUF106基因的非生物脅迫耐受性進(jìn)行研究，這將加深對DUF106基因功能的認(rèn)識，期望能為林木遺傳育種提供良好的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所需野生型煙草(Nicotianatabacum)種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司(美國)；PCR相關(guān)試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase、PrimeScriptTMRT reagent Kit購自TaKaRa公司(中國大連)；EASYPureTMPlant RNA Kit、pEASY-T1、大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購自Transgen(中國)；農(nóng)桿菌GV3101為本實(shí)驗(yàn)室保存；pROKⅡ載體由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈；其他實(shí)驗(yàn)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2　檉柳總RNA提取及ThDUF106基因的克隆

用EASYPureTMPlant RNA Kit試劑盒提取檉柳的總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模版，利用表1中的引物(ThDUF106-F/R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃再延伸7 min，PCR結(jié)束后將全部產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收后的片段根據(jù)操作手冊介紹方法連入pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，涂LB抗性平板(卡那抗性)，對獲得的單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，篩選后的陽性克隆命名為pEASY-T1-ThDUF106，送至哈爾濱新?；驒z測有限公司測序。

1.3　植物表達(dá)載體構(gòu)建

通過表1引物(ThDUF106-F/R)擴(kuò)增的目的片段，將獲得的目的片段和pROKⅡ載體質(zhì)粒同時利用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、SacⅠ進(jìn)行雙酶切，并分別切膠回收目的片段，利用T4DNA ligase過夜連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，涂LB抗性平板(卡那抗性)，對獲得的單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，篩選后的陽性克隆命名為pROKⅡ-ThDUF106，送至哈爾濱新?；驒z測有限公司測序。

表1　本研究使用的引物

選取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，提取農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒根據(jù)表1中的引物(pROKⅡ-F/R)進(jìn)行PCR檢測。

1.4　轉(zhuǎn)基因煙草獲得及分子檢測

通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過程如下：預(yù)培1～2 d；農(nóng)桿菌(OD=0.6)侵染5 min；共培1 d；脫菌。經(jīng)一個月后獲得抗性株系。對抗性株系進(jìn)行分子檢測，用CTAB方法提取抗性植株總DNA，利用表1引物進(jìn)行PCR并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出陽性轉(zhuǎn)基因株系。

1.5　轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)時熒光定量PCR檢測

利用實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證ThDUF106基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，將獲得的轉(zhuǎn)基因株系用EASYPureTMPlant RNA Kit試劑盒提取植株的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將合成的第一鏈cDNA加去離子水稀釋10倍，作為模版，以Ntactin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見表1。反應(yīng)體系為20 μL；其中2×SYBR Green 10 μL，ROX Dye Ⅱ 0.4 μL，2 μL cDNA模板，正反向引物(ThDUF106-RT-F/R)各0.8 μL。qRT-PCR的擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)，反應(yīng)完畢后，獲取數(shù)據(jù)并通過2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析。

1.6　轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率檢測

選取表達(dá)量高中低的3個株系的轉(zhuǎn)基因煙草株系(pROKⅡ-ThDUF106-L1、L2、L8；)和野生型煙草WT種子，在無菌條件下，培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上(轉(zhuǎn)基因煙草種子培養(yǎng)在含有卡那抗性的基本培養(yǎng)基中)進(jìn)行非生物脅迫并重復(fù)3次，對種子萌發(fā)率進(jìn)行檢測。

1.7　轉(zhuǎn)基因煙草非生物脅迫及生理生化指標(biāo)測定

選取表達(dá)量高中低的3個株系的轉(zhuǎn)基因煙草株系(pROKⅡ-ThDUF106-L1、L2、L8；)和野生型煙草WT種子，在無菌條件下，培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上(轉(zhuǎn)基因煙草種子培養(yǎng)在含有50 mg·L-1kana的基本培養(yǎng)基中)。待長出4片子葉后，將其移栽到土盆中，溫室培養(yǎng)1個月，每個株系分別選取長勢基本一致的3盆幼苗，進(jìn)行非生物脅迫(300 mmol·L-1NaHCO3、400 mmol·L-1NaCl、400 μmol·L-1CdCl2、20% PEG)處理，處理10天，期間每5天澆一次，并將流到托盤的處理液回澆土盆中。一周后進(jìn)行取材，取材部位為靠近根部的3～4片葉子，選三棵煙草混合取樣。并進(jìn)行生理生化指標(biāo)測定，并重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1　檉柳總RNA提取及ThDUF106基因的克隆

利用RNA提取試劑盒從檉柳中成功提取總RNA(圖1A)，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，獲得條帶與預(yù)期ThDUF106基因大小一致(圖1B)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，隨機(jī)挑取單克隆，并經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證(圖1C)，并對篩選出的陽性克隆進(jìn)行測序檢測，測序結(jié)果通過Bioedit生物軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，克隆片段與目的基因100%相同，將測序正確的菌落命名為pEASY-T1-ThDUF106。

圖1　檉柳總RNA提取和ThDUF106基因的克隆鑒定　A.檉柳RNA：M. DNA marker DL5000；1～2.檉柳RNA　B.檉柳ThDUF106基因的克?。篗. DNA marker DL5000；1. ThDUF106基因PCR產(chǎn)物　C. pEASY-T1-ThDUF106載體在大腸桿菌菌液中PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～8. pEASY-T1-ThDUF106 PCR產(chǎn)物Fig.1　The total RNA of Tamarix hispida and clone and verification of ThDUF106 gene　A. Total RNA of T.hispida: M. DNA marker DL5000; 1-2. Total RNA of T.hispida　B. The cloning of ThDUF106 gene: M. DNA marker DL5000; 1. PCR product of ThDUF106 gene　C. PCR detection of pEASY-T1-ThDUF106 in E.coli: M. DNA marker DL5000; 1-8. PCR product of pEASY-T1-ThDUF106

2.2　植物表達(dá)載體構(gòu)建

植物表達(dá)載體圖譜如圖2所示，并根據(jù)該圖譜進(jìn)行載體構(gòu)建。步驟如下：對測序正確的pEASY-T1-ThDUF106菌液提質(zhì)粒，之后與pROKⅡ載體質(zhì)粒，同時用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、SacⅠ做雙酶切，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3A)，對目的片段切膠回收，并利用T4DNA ligase連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，涂LB抗性平板(卡那抗性)，隨機(jī)挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，篩選出陽性克隆，命名為pROKⅡ-ThDUF106，將菌液送公司測序，結(jié)果表明，ThDUF106基因成功整合到pROKⅡ載體上，之后通過液氮凍融法將pROKⅡ-ThDUF106質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取8個單克隆，經(jīng)PCR檢測(圖3B)，均為陽性克隆，并標(biāo)記為(pROKⅡ-ThDUF106)。

圖2　植物表達(dá)載體pROKⅡ-ThDUF106的構(gòu)建圖譜Fig.2　Plant expression vector constructs pROKⅡ-ThDUF106 map

圖3　植物表達(dá)載體pROKⅡ-ThDUF106的構(gòu)建及檢測　A.限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果；M. DNA marker DL5000；1. pROKⅡ載體質(zhì)粒雙酶切條帶；2. pEASY-T1-ThDUF106質(zhì)粒雙酶切條帶　B.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測；M. DNA marker DL5000；1～8. GV3101(pROKⅡ-ThDUF106)轉(zhuǎn)化子菌液PCR檢測農(nóng)桿菌Fig.3　Construction and detection of plant expression vector pROKⅡ-ThDUF106　A. Electrophoretogram of restriction enzymes digestion: M. DNA marker DL5000; 1. Digestion of pROKⅡ vector with SmaⅠ and SacⅠ; 2. Digestion of pEASY-T1-ThDUF106 with SmaⅠ and SacⅠ　B. PCR detection of Agrobacterium-mediated transformation: M. DNA marker DL5000; 1-8. PCR products of transformants in Agrobacterium

2.3　轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測

用含有pROKⅡ-ThDUF106農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，經(jīng)4～6周的選擇培養(yǎng)，從葉片周圍生成大量抗性芽。待抗性芽長出葉片后，將葉片切下放在含有LB抗性平板(卡那抗性)的分生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)(圖4)。將兩次分化獲得的芽在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根定植，最終共獲得17株轉(zhuǎn)基因煙草植株。提取已獲得有抗性的轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA，利用表1中pROKⅡ通用引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(圖5)，結(jié)果顯示抗性植株中均含有目的基因，說明外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中。

2.4　實(shí)時定量RT-PCR分析

為了研究檉柳ThDUF106基因在煙草植株中的表達(dá)情況，提取煙草總RNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。與野生型煙草比，檉柳ThDUF106基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均有表達(dá)，表達(dá)量較高的株系有1、2、8、12、和11，表達(dá)量最高的株系是1、2和8(圖6)，選這3個株系用于下一步的后續(xù)分析。

圖4　轉(zhuǎn)基因植株的獲得及PCR檢測　A-B.選擇培養(yǎng)基上形成的抗性芽；C.轉(zhuǎn)基因植株生根苗Fig.4　The obtaining and PCR detection of transgenic plants　A-B. The putative transgenic shoot buds; C. The transgenic seedling for rooting

圖5　轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測　A. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106)轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～13. 13個抗性植株的DNA PCR檢驗(yàn)；14. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106基因)質(zhì)粒陽性對照；15.WT；16. ddH2O作為陰性對照　B. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106基因)轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～5. 5個抗性苗DNA PCR檢驗(yàn)；6. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106基因)質(zhì)粒陽性對照；7.WT；8. ddH2O作為陰性對照Fig.5　PCR detection of transgenic plants　A. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106 gene) PCR detection of transgenic lines: M. DNA marker DL5000; 1-13. PCR detection of 10 resistant plants; 14. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106 gene) plasmid positive control; 15.WT; 16. ddH2O as a negative control　B. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106 gene) PCR detection of transgenic lines: M. DNA marker DL5000; 1-5. DNA PCR detection of 5 resistant plants; 6. GV1301(pROKⅡ-ThDUF106 gene) plasmid positive control; 7.WT; 8. ddH2O as a negative control

圖6　轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測　WT.野生型煙草；1～17. 17個ThDUF106轉(zhuǎn)基因煙草植株Fig.6　qRT-PCR detection of transgenic plants　WT. Wild type tobacco；1-17. 17 ThDUF106 transgenic tobacco plants

2.5　轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率檢測

選取表達(dá)量高中低的3個株系的轉(zhuǎn)基因煙草株系和野生型煙草WT種子，培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行非生物脅迫并重復(fù)3次，對種子萌發(fā)率進(jìn)行檢測(圖7)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系與野生型相近。

圖7　ThDUF106基因轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)脅迫實(shí)驗(yàn)Fig.7　The experiment of ThDUF106 transgenic tobacco plant seeds germination under stress

2.6　轉(zhuǎn)基因煙草非生物脅迫及生理生化檢測

對一月齡的轉(zhuǎn)基因煙草T2代幼苗進(jìn)行逆境脅迫對幼苗進(jìn)行非生物脅迫處理一周(圖8)，分別取同一株系不同植株的幼苗從下至上三片葉片，進(jìn)行POD、SOD、MDA活性檢測，結(jié)果顯示，在對照(水)處理下，ThDUF106轉(zhuǎn)基因株系和野生型的POD活性基本相同；在NaHCO3、NaCl脅迫下，POD活性無顯著性差異；在PEG、CdCl2脅迫下ThDUF106轉(zhuǎn)基因株系的POD活性均較高于野生型，呈顯著性差異(圖9)。

圖8　ThDUF106煙草轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行非生物脅迫處理結(jié)果　A.水處理；B.NaCl脅迫；C. PEG脅迫；D. CdCl2脅迫；D. NaHCO3脅迫Fig.8　The result of non-biological stress treatment of ThDUF106 transgenic tobacco plants　A. Water; B. NaCl stress; C. PEG stress; D. CdCl2 stress; D. NaHCO3 stress

圖9　ThDUF106轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草葉片非生物脅迫處理結(jié)果　A. POD檢測分析結(jié)果；B. SOD檢測分析結(jié)果；C. MDA檢測分析結(jié)果Fig.9　The result of non-biological stress treatment of ThDUF106 transgenic tobacco plants and non-transgenic tobacco　A. POD detection analysis results; B. SOD detection analysis results; C. MDA detection analysis results

4　討論

檉柳(Tamarixhispida)屬中約有90種能夠表現(xiàn)出既能夠高度適應(yīng)不同環(huán)境又能夠表現(xiàn)出高耐逆境生長[18～19]，在地中海和沿海地區(qū)由于人類過度開發(fā)影響了生態(tài)環(huán)境，因此需要種植一些能夠耐受重金屬和其他非生物脅迫的植物來抵御惡劣的環(huán)境，以便該地區(qū)環(huán)境能夠得到改善[18,20]，如：紅花多枝檉柳(Tamarixgallica)是一種在地中海地區(qū)常見的物種，它表現(xiàn)出高度耐受重金屬污染的土壤[18]。由于檉柳這一物種能夠承受極端的環(huán)境條件[21]，因此常被用來作為生長在土壤環(huán)境極度惡劣的生物改良物種[22～23]。檉柳可以在其生態(tài)生理學(xué)中顯示出在某種環(huán)境中導(dǎo)致不同水平的適應(yīng)性的差異，因此對其抗性和潛在價值的了解可以幫助人們選擇優(yōu)良的物種及對林木育種提供理論依據(jù)[24]。

未知蛋白結(jié)構(gòu)域通過結(jié)構(gòu)基因組學(xué)對DUF的功能進(jìn)行確定，現(xiàn)在已有250個DUF的結(jié)構(gòu)已被確定，其中1/3的DUF家族被確定為含有新的結(jié)構(gòu)形態(tài)；其余2/3則與現(xiàn)有的超家族蛋白的結(jié)構(gòu)相似[25]。到2013年為止，細(xì)菌中約有2 700個；真核生物中約有1500個，并且二者有交集的蛋白結(jié)構(gòu)域約800個[20]。由于許多DUF生物學(xué)功能呈未知狀態(tài)，而展現(xiàn)出其在生物體中是不必需的，如DUF143存在于大多數(shù)細(xì)菌和真核生物基因組中，但在大腸桿菌中缺失后，正常培養(yǎng)下沒有觀察到明顯表型，只有當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)匱乏時該基因才具有關(guān)閉蛋白質(zhì)合成的功能[26]，這表明許多DUF只在特殊環(huán)境下才會被需要。

DUF106在植物的生長和脅迫應(yīng)答中的作用并不清楚，根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，如，來自古細(xì)菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)的DUF106蛋白為一種膜插入酶[17];水稻的DUF1644基因在水稻中能夠?qū)}堿和干旱脅迫有應(yīng)答[27]；水稻中過表達(dá)OsDSR2基因合成的蛋白中含有DUF966結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致水稻對鹽和干旱脅迫呈敏感性[28]。以上研究表明,一些DUF結(jié)構(gòu)域在植物中會對非生物脅迫有應(yīng)答，但是，到目前為止，關(guān)于檉柳DUF106基因的研究還未見報道。在本試驗(yàn)中，通過克隆檉柳ThDUF106基因，并構(gòu)建植物表達(dá)載體，對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)而對脅迫下的ThDUF106基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行生理生化檢測，探究以上基因在過表達(dá)條件下對煙草產(chǎn)生的影響，為林木抗逆基因工程育種提供參考。

1.Qin F,Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozaki K.Achievements and challenges in understanding plant abiotic stress responses and tolerance[J].Plant and Cell Physiology,2011,52(9):1569-1582.

2.Boyer J S.Plant productivity and environment[J].Science,1982,218(4571):443-448.

3.Endler A,Kesten C,Schneider R,et al.A mechanism for sustained cellulose synthesis during salt stress[J].Cell,2015,162(6):1353-1364.

4.Boudsocq M,Barbier-Brygoo H,Laurière C.Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses inArabidopsisthaliana[J].The Journal of Biological Chemistry,2004,279(40):41758-41766.

5.Parida A K,Das A B.Salt tolerance and salinity effects on plants:a review[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2005,60(3):324-349.

6.Li Y,Liu P P,Takano T,et al.A chloroplast-localized rubredoxin family protein gene fromPuccinelliatenuiflora(PutRUB) increases NaCl and NaHCO3tolerance by decreasing H2O2accumulation[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(6):804.

7.張國軍.鹽脅迫對4種景天幼苗水勢、熒光效率、丙二醛的影響[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2012(7):3-6.

Zhang G J.Effect of salt stress on the water potential,fluorescence efficiency,malonaldehyde of four stonecrop seedlings[J].Agricultural Science & Technology and Equipment,2012(7):3-6.

8.Liu J,Guo W Q,Shi D C.Seed germination,seedling survival,and physiological response of sunflowers under saline and alkaline conditions[J].Photosynthetica,2010,48(2):278-286.

9.劉鐸,叢日春,黨宏忠,等.柳樹幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對中、堿性鈉鹽響應(yīng)的差異性[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2014,23(9):1531-1535.

Liu D,Cong R C,Dang H Z,et al.Comparative effects of salt and alkali stresses on plant physiology of willow[J].Ecology and Environmental Sciences,2014,23(9):1531-1535.

10.Zhu J K.Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annual Review of Plant Biology,2002,53:247-273.

11.Zhu J H,Lee B H,Dellinger M,et al.A cellulose synthase-like protein is required for osmotic stress tolerance inArabidopsis[J].The Plant Journal,2010,63(1):128-140.

12.Guo L Q,Shi D C,Wang D L.The key physiological response to alkali stress by the alkali-resistant halophytePuccinelliatenuiflorais the accumulation of large quantities of organic acids and into the rhyzosphere[J].Journal of Agronomy and Crop Science,2010,196(2):123-135.

13.Rosegrant M W,Cline S A.Global food security:challenges and policies[J].Science,2003,302(5652):1917-1919.

14.Guo L Q,Shi D C,Wang D L.The key physiological response to alkali stress by the alkali-resistant halophytePuccinelliatenuiflorais the accumulation of large quantities of organic acids and into the rhyzosphere.J.Agron.Crop Sci,2010,196:123-135.

15.鄒原東,范繼紅.有機(jī)肥施用對土壤肥力影響的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,29(3):12-16.

Zou Y D,Fan J H.Review on effect of organic fertilizer on soil fertility[J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2013,29(3):12-16.

16.Mishra A,Jha B.Antioxidant response of the microalgaDunaliellasalinaunder salt stress[J].Botanica Marina,2011,54(2):195-199.

17.Sairam R K,Rao K V,Srivastava G C.Differential response of wheat genotypes to long term salinity stress in relation to oxidative stress,antioxidant activity and osmolyte concentration[J].Plant Science,2002,163(5):1037-1046.

18.Jaoudé R A,De Dato G,De Angelis P.Photosynthetic and wood anatomical responses ofTamarixafricanaPoiret to water level reduction after short-term fresh-and saline-water flooding[J].Ecological Research,2012,27(5):857-866.

19.Gries D,Zeng F,Foetzki A,et al.Growth and water relations ofTamarixramosissimaandPopuluseuphraticaon Taklamakan desert dunes in relation to depth to a permanent water table[J].Plant,Cell & Environment,2003,26(5):725-736.

20.Goodacre N F,Gerloff D L,Uetz P.Protein domains of unknown function are essential in bacteria[M].Bio,2013,5(1):e00744-13.

21.Cleverly J R,Smith S D,Sala A,et al.Invasive capacity ofTamarixramosissimain a Mojave desert floodplain:the role of drought[J].Oecologia,1997,111(1):12-18.

22.De Baets S,Poesen J,Reubens B,et al.Root tensile strength and root distribution of typical Mediterranean plant species and their contribution to soil shear strength[J].Plant and Soil,2008,305(1-2):207-226.

23.Ma Q L,Wang J H,Li X R,et al.Long-term changes ofTamarixvegetation in the oasis-desert ecotone and its driving factors:implication for dryland management[J].Environmental Earth Sciences,2009,59(4):765-774.

24.Grisafi F,Oddo E,Gargano M L,et al.Tamarixarboreavar.arboreaandTamarixparviflora:Two species valued for their adaptability to stress conditions[J].Acta Biol Hung,2016,67(1):42-52.

25.Farghaly F A,Radi A A,Abdel-Wahab D A,et al.Effect of salinity and sodicity stresses on physiological response and productivity inHelianthusannuus[J].Acta Biologica Hungarica,2016,67(2):184-194.

26.Kadukova J,Manousaki E,Kalogerakis N.Pb and Cd accumulation and phyto-excretion by salt cedar(TamarixsmyrnensisBunge)[J].International Journal of Phytoremediation,2008,10(1):31-46.

27.Moreno-Jiménez E,Vázquez S,Carpena-Ruiz R O,et al.Using Mediterranean shrubs for the phytoremediation of a soil impacted by pyritic wastes in Southern Spain:a field experiment[J].Journal of Environmental Management,2011,92(6):1584-1590.

28.Luo C,Guo C,Wang W,et al.Overexpression of a new stress-repressive gene OsDSR2 encoding a protein with a DUF966 domain increases salt and simulated drought stress sensitivities and reduces ABA sensitivity in rice[J].Plant Cell Rep,2014,33(2):323-336.