龔道勇　胡尚連*　曹　穎　盧學琴　張慶波

(1.西南科技大學植物細胞工程實驗室，綿陽　621010； 2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，綿陽　621010)

竹子在我國種類多，分布廣，具有生產(chǎn)周期短和易更新的特點，且是一種不可或缺的可再生資源，有著廣闊的開發(fā)利用前景[1]。慈竹(Bambusaemeiensis)為叢生竹類，屬于禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)慈竹屬(Bambusaemeiensis)，是西南地區(qū)的優(yōu)勢竹種，其節(jié)間長，纖維素含量多，纖維長徑比較大，分子聚合度相對較高，是造紙的良好材料[2～3]。但是慈竹本身易受冷凍脅迫、土壤干旱等影響，從而造成慈竹大面積減產(chǎn)。因此，探究如何提高它對低溫或干旱脅迫的抗性十分重要。

以往對慈竹的研究主要集中在基因的克隆[4]、生理生化[5]、遺傳的多樣性[6]等方面的研究，而有關(guān)慈竹bZIP基因克隆表達方面的研究鮮有報道。有研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育：例如在小麥的187個bZIP基因中，發(fā)現(xiàn)有48個與花藥的發(fā)育有關(guān)[7]；擬南芥中C/S1亞族的bZIP轉(zhuǎn)錄因子在能量不足或者環(huán)境脅迫下參與植株生長的重新分配[8]；而G亞族的GIP1則參與到植株早期的生長發(fā)育[9]。光信號的轉(zhuǎn)導：擬南芥中的GBF1在藍光誘導下參與光形態(tài)的建成，如子葉擴張的正調(diào)控[10]；而對于一些藻類植物，在bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與下，它可以不利用光合通路，而完成光合作用[11]。種子的萌發(fā)：如分析蓖麻種子時，發(fā)現(xiàn)了49個RcbZIP基因與種子萌發(fā)和保藏相關(guān)[12]；而水稻中OsABI5可以提高水稻種子的萌發(fā)率[13]。基因的表達：在西紅柿中，進行了全基因組的系統(tǒng)鑒定，為蛋白質(zhì)功能分析提供理論依據(jù)[14]。病蟲害的防御：如對四種大豆的bZIP基因進行銹病脅迫實驗，獲得了新的基因型可以提高對銹病的抗性[15]；在胡椒中，發(fā)現(xiàn)了一個CAbZIP1基因，它可以增強對胡椒病原體的抗性[16]。生物和非生物脅迫應答：如Atkinson等從基因的角度，分析了植物生物脅迫和非生物脅迫的相互作用是通過激素信號通路使之結(jié)合在一起[17]；在小麥中bZIP轉(zhuǎn)錄因子是通過分子構(gòu)象的不同來影響其結(jié)構(gòu)與功能[18]；依賴于ABA信號的bZIP轉(zhuǎn)錄因子通過Ser/Thr激酶參與到非生物脅迫中，如水稻ABF1對冷脅迫的響應[19]。以及ABA敏感性等各種信號的響應[20]。鑒于此，本次研究基于慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[21]，利用克隆得到兩條序列，對其進行生物信息學分析、組織表達以及非生物脅迫表達分析，為慈竹的抗凍、耐鹽、抗旱等提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　植物材料

采自西南科技大學生命科學與工程學院竹類資源圃的慈竹筍(高100 cm)、當年生且完全抽枝的慈竹莖稈、展開葉和未展開葉作為試驗材料，于液氮中冷凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　主要試劑和菌種

寶生物(大連)TaKaRa公司：DL2000 DNA Marker、LA-Taq聚合酶、pMD19-T載體、IPTG、PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect DNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ApaⅠ、XbaⅠ、KpnⅠ等;天根公司：質(zhì)粒小提試劑盒、X-Gal和膠回收試劑盒;OMEGA BIO-TEK公司：Plant RNA Kit試劑盒;BioBRK公司：Green View染料;GeneTech公司：酵母提取物、瓊脂糖和胰蛋白胨;大腸桿菌(E.coli)DH5α為本試驗室制備保存。

1.3　試驗方法

1.3.1慈竹總RNA的提取和cDNA的合成

以-80℃超低溫冰箱保存的慈竹筍(高100 cm)、莖稈、展開葉和未展開葉為材料，按照OMEGA公司Plant RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA。按照寶生物公司的PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect DNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.2慈竹BebZIP2和BebZIP6的克隆

從慈竹筍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出2條序列，采用Premier 5.10軟件設(shè)計兩對引物(BebZIP2-F和BebZIP2-R；BebZIP6-F和BebZIP6-R，表1)，對其進行克隆。按照擴增反應程序：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃*BebZIP2基因退火溫度為55℃，BebZIP6為58℃。退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保持。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，回收后用大連寶生物T4ligase試劑盒進行pMD19-T載體連接，42℃熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,篩選陽性克隆酶切驗證后送至上海英濰捷基公司進行測序，保留測序正確的質(zhì)粒進行下一步實驗。

1.4　生物信息學分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/)中獲得其它物種bZIP基因的功能性氨基酸和核苷酸序列，用DAMBE檢測飽和度[22]；為不飽和狀態(tài)，適合建樹。用DNAMAN軟件和在線程序Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)對基因序列及其編碼的氨基酸序列進行多序列比對分析；用Mega7.0軟件采用最大似然法(Maximum Likehood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本次研究選擇Models(Find Best DNA/Protein Models)為JTT+G+F，Bootstrap參數(shù)設(shè)為1 000 replicates；用MEME(http://meme-suite.org/index.html)、Phyre2.0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/)等在線軟件工具分別對bZIP蛋白序列進行保守基序和三級結(jié)構(gòu)分析；用Yloc[23～24](http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi)進行亞細胞定位預測分析(選擇模型：Plants YLoc-HighRes)。將已克隆得到的慈竹2條BebZIP基因的編碼框CDS序列提交至Selecton(http://selecton.tau.ac.il/)在線程序[25～26]，設(shè)置模型為力學—經(jīng)驗型模型(MEC)，對這2個基因進行選擇性壓力分析。

1.5　慈竹BebZIP基因組織表達模式分析

根據(jù)測序的慈竹BebZIP2和BebZIP6基因的全長序列，設(shè)計real-time PCR引物(BebZIP2-RT-F和BebZIP2-RT-R；BebZIP6-RT-F和BebZIP6-RT-R，表1)。分別提取慈竹各組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；在iQ Multicolor Real-Time PCR自動擴增儀進行反應，每個樣品重復3次，反應體系20 μL。以內(nèi)參基因Tubulin為對照，用2-ΔΔCT計算法[27]計算其相對表達量。

表1　慈竹BebZIP2和BebZIP6基因克隆和Real-time PCR分析所用引物

1.6　慈竹BebZIP基因非生物脅迫表達分析

采用1/10 Hoagland營養(yǎng)液,將慈竹幼苗培養(yǎng)30 d左右，選擇生長情況幾乎一致且生長良好的幼苗作為試驗材料。每個處理分別設(shè)置6個試驗梯度：NaCl(0、50、100、150、200、250 mmol·L-1)、ABA(0、5、10、50、100、200 μmol·L-1)、PEG6000(0%、5%、10%、15%、20%、25%)進行預實驗，每個處理重復3次(每個重復取3個獨立植株)。

預實驗結(jié)果顯示：250 mmol·L-1NaCl處理3 d后，慈竹幼苗枯萎死亡，200 mmol·L-1NaCl處理的幼苗葉尖部位變黑，其他濃度的NaCl處理后，整株幼苗無明顯變化；200 μmol·L-1ABA處理2 d后，幼苗的葉邊緣的綠色明顯變?yōu)辄S色，而其他濃度的ABA處理的幼苗均無明顯變化；20% PEG6000處理2 d后，可觀察到幼苗葉呈卷曲狀，25% PEG6000處理的幼苗葉卷曲比較嚴重且干癟，其他濃度的PEG6000處理后，整株幼苗無明顯變化。根據(jù)預實驗結(jié)果最終確定以NaCl(0、200 mmol·L-1)、ABA(0、200 μmol·L-1)、PEG6000(0%、20%)進行后續(xù)的脅迫試驗，每個處理重復3次(每個重復取3個獨立植株)，分別處理0(未處理的對照組)、6、12、24、48 h及7 d后，選取脅迫處理后的慈竹葉作為試驗材料，液氮處理后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA;合成cDNA;以內(nèi)參基因Tubulin為對照，用2-ΔΔCT計算法計算其相對表達量。

2　結(jié)果與分析

2.1　慈竹BebZIP2和BebZIP6基因的克隆

用幼嫩的慈竹筍cDNA為模版，通過設(shè)計基因特異引物，經(jīng)PCR擴增獲得了2條DNA序列(圖1)，將其克隆到pMD19-T載體上，獲得陽性克隆并測序。用NCBI在線工具Conserved分別對其進行保守結(jié)構(gòu)預測并將這兩條序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫注冊；保守結(jié)構(gòu)預測屬于bZIP超家族，命名為BebZIP2和BebZIP6(GenBank注冊號分別為KU554693和KU560573)。其中BebZIP2和BebZIP6編碼區(qū)長度分別為504 bp(編碼167個氨基酸)和720 bp(編碼239個氨基酸)。

2.2　慈竹BebZIP2和BebZIP6蛋白進化樹分析及多序列比對分析

用慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出的bZIP(BebZIP1-BebZIP6)蛋白序列，結(jié)合單子葉植物：水稻(Oryzasativa：OsZIP-1a；OsZIP-2b；TRAB1；RF2a；RF2b；RISBZ1；RISBZ4；RISBZ5；RITA-1；OsBZ8)；小麥(Triticumaestivum：EmBP-1；HBP-1a(1)；HBP-1b(c1)；HBP-1b(c38);HALF1；SPA)；玉米(Zeamays：CPRF-2；DFL1；LG2；OHP1；OHP2；Maize O2；ZmGBF1；ZmBP-1a；OBF3.1；OBF3.2)和雙子葉植物擬南芥(Arabidopsisthaliana：BZO2H1；BZO2H2；BZO2H3；BZO2H4)；大豆(Glycinemax：HBF1)等已知功能的bZIP蛋白構(gòu)建進化樹，分析得知BebZIP2與玉米的CPRF-2置信度達到了65%；BebZIP2和BebZIP6與水稻C亞族的RISBZ5蛋白聚在一枝，置信度為90%(圖2)。CPRF-2即bZIP17，它與光誘導相關(guān)[28]。RISBZ5即OsbZIP52，它參與水稻對脅迫的響應，在低溫脅迫下其表達量可迅速提升，說明它可能是調(diào)控冷和滲透壓脅迫途徑中的一部分，同時相關(guān)研究表明，OsbZIP52基因的過表達可以提高水稻幼苗對冷和干旱脅迫的敏感程度[29]。因而，推測BebZIP2和BebZIP6基因的功能參與到慈竹對冷和干旱等非生物脅迫的響應。

圖1　慈竹bZIP基因PCR擴增產(chǎn)物　M.DL2000 Maker；1.BebZIP6 PCR擴增產(chǎn)物；2.BebZIP2 PCR擴增產(chǎn)物Fig.1　Electrophoresis of PCR products of bZIP genes in B.emeiensis　M. DL2000 Maker; 1.Amplification products of BebZIP6 PCR; 2.Amplification products of BebZIP2 PCR

選取與BebZIP2和BebZIP6同源性較高的氨基酸序列，用DNAMAN軟件和在線程序Clustal Omega進行多序列比對分析(圖3)?？梢园l(fā)現(xiàn)它們存在典型的堿性亮氨酸拉鏈區(qū)域[N—X(7)—R/K—X(9)—L—X(6)—L—X(6)—L]，圖中黃色區(qū)域且該區(qū)域非常的保守。

圖2　不同物種bZIP蛋白的進化樹分析Fig.2　Phylogenetic analysis of deduced amino acids of bZIP proteins from different plants

圖3　BebZIP氨基酸序列與其他物種bZIP蛋白氨基酸序列多重比對結(jié)果　“*”表示保守氨基酸；“：”表示保守替換；“.”表示非保守替換Fig.3　Multiple alignment analysis of bZIP conservative structure domain in different plants　“*” represents a conserved amino acid; “:” represents a conservative replacement; “.” represents non conservative replacement

圖4　慈竹BebZIP2和BebZIP6蛋白保守基序分析Fig.4　The conserved motif analysis of BebZIP2 and BebZIP6 protein

圖5　bZIP蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預測　A. c2wt7B的三級結(jié)構(gòu)；B. RISBZ5的三級結(jié)構(gòu)；C. BebZIP2的三級結(jié)構(gòu)；D. BebZIP6的三級結(jié)構(gòu)Fig.5　bZIP protein tertiary structure prediction　A. Tertiary structure of model c2wt7B; B. Tertiary structure of RISBZ5; C. Tertiary structure of BebZIP2; D. Tertiary structure of BebZIP6

2.3　慈竹BebZIP氨基酸保守基序分析

用MEME軟件分析慈竹2條bZIP氨基酸序列的保守基序，設(shè)置基序數(shù)量為6個，寬度不限。結(jié)果顯示，這些氨基酸序列均含有高度保守的motif1-motif5核心保守基序(圖4)。其中，BebZIP6的結(jié)構(gòu)與水稻RISBZ5蛋白的保守基序幾乎完全相同，與進化分析結(jié)果一致。BebZIP2的motif2、motif4和motif5則組合在了一起。

2.4　慈竹BebZIP基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預測分析

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步折疊盤繞而成。利用已經(jīng)被X-Ray解析出晶體模型的c2wt7B(NDB:NA0777)為模型[30],c2wt7B具有典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。用Phyre 2.0對BebZIP2和BebZIP6進行三級結(jié)構(gòu)進行預測。結(jié)果顯示這兩個蛋白與c2wt7B的三級構(gòu)型高度相似，猶如一條拉鏈。如圖5可以看出，BebZIP2和BebZIP6的三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成。Yloc亞細胞定位預測結(jié)果表明，BebZIP2主要集中于細胞核的概率為99.99%(置信度為1)，BebZIP6主要集中于細胞核的概率為100.00%(置信度為1)；實際情況需進一步實驗去驗證。

2.5　慈竹BebZIP基因的選擇性進化分析

運用Selecton程序中的MEC模型在慈竹bZIP氨基酸序列上探測正選擇位點。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)位點的標注顏色大部分為白色到深紫色之間，表明這些位點經(jīng)歷了強的凈化選擇位點，而標注為黃色的位點，說明這些位點受到陽性選擇壓力。由圖6可見在MEC模型下，慈竹bZIP基因中凈化選擇壓力和陽性選擇壓力共同主導了它們的進化。

圖6　慈竹bZIP基因選擇性壓力檢測Fig.6　bZIP genes selective pressure detection in B.emeiensis

2.6　慈竹BebZIP基因的組織表達分析

組織表達分析結(jié)果顯示，這2條BebZIP基因在慈竹筍、展開葉和未展開葉以及莖中均有表達，但其在各個部位的表達量有差異(圖7)?？傮w上看，它們在不同組織中的表達趨勢不盡相同，但均在未展開葉中表達量較高，在筍和莖中表達量的差異不大。同一基因在不同組織中的表達量差異較大，表達量的大小為未展開葉>展開葉>莖>筍。

2.7　慈竹BebZIP基因的非生物脅迫分析

經(jīng)過脅迫處理后，觀察預實驗幼苗(圖8)，與CK比較，200 mmol·L-1NaCl處理2 d后,幼苗葉尖部位變黑；20% PEG-6000處理2天后，可觀察到幼苗葉呈卷曲狀；200 μmol·L-1ABA處理2 d后，幼苗的葉邊緣的綠色明顯變?yōu)辄S色。

圖7　實時定量PCR分析2個BebZIP基因在不同組織中的表達Fig.7　Quantitative real-time PCR analysis of the expression pattern of 6 BebZIP genes in different tissues

圖8　脅迫處理后植株的變化Fig.8　The phenotype of the plant after treatments

在NaCl(200 mmol·L-1)、PEG6000(20%)和ABA(200 μmol·L-1)3種脅迫條件的處理下(圖9)，BebZIP2基因的表達情況基本一致，表現(xiàn)為先下降，后上升，最后再下降。在NaCl、PEG6000和ABA處理6 h后其表達量顯著下降，但隨著脅迫時間的延長，它的表達量緩慢上升，脅迫7天后BebZIP2的表達量又開始下降。

然而，BebZIP6在3種脅迫環(huán)境下的表達情況與BebZIP2明顯不同，在NaCl和PEG處理條件下，大多數(shù)脅迫時間點下其表達水平與對照初始水平差異不大，且脅迫7天后其表達量均與對照基本持平。而在ABA處理條件下，BebZIP6基因的表達量呈現(xiàn)波浪線形狀變化，依次表現(xiàn)為上升，下降，上升，下降，最后上升到與對照組水平基本持平。

圖9　BebZIP2和BebZIP6對脅迫處理下的表達變化A. NaCl處理；B. PEG6000處理；C. ABA處理Fig.9　Differential expression of BebZIP2 and BebZIP6 under the different stress treatments　A. NaCl treatment; B. PEG6000 treatment; C. ABA treatment

3　討論

bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族在整個真核生物界中扮演著重要角色。在植物中，bZIP可以調(diào)控包括光形態(tài)建成、葉和種子的發(fā)育、能量平衡、以及生物和非生物脅迫響應等一系列重要的生物學過程[31]。由于慈竹的這兩個基因?qū)儆贑亞族。有研究表明大豆C亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子GmbZIP62在ABA信號傳導中通過上調(diào)ABI1和ABI2等逆境相關(guān)基因的表達，從而可能在逆境脅迫中起作用[32]；玉米C亞族的Opaque2通過和PBF蛋白的相互作用調(diào)控種子儲存蛋白的產(chǎn)量[33]；歐芹C亞族的CPFR-2和G/HBF-1可能還與對環(huán)境和病害侵襲的防御反應有關(guān)[34～35]；在水稻中OsbZIP23的過表達能顯著提高水稻的耐鹽性、抗旱性和ABA敏感性；在對照植株中，水稻的耐鹽性、抗旱性和ABA敏感性也隨之降低比較明顯，這表明OsbZIP23基因在水稻的耐鹽和抗旱過程中起到了非常重要的作用[36]。

慈竹這兩個基因與水稻C亞族的OsbZIP52同源性較高，而亞細胞定位表明OsbZIP52定位于細胞核[28]；推測BebZIP2和BebZIP6也定位于為細胞核，這與Yloc亞細胞定位預測結(jié)果相一致，但需要進一步實驗去驗證。水稻中，OsbZIP52作為反式激活因子能與順式作用元件G-Box特異性結(jié)合，提高對寒冷和干旱的敏感性[29]。在水稻中，通過Realtime PCR分析OsbZIP52的過表達，其非生物脅迫相關(guān)基因，如OsLEA3,OsTPP1,Rab25,gp1precursor,β-gal,LOC_Os05g11910和LOC_Os05g39250等基因都下調(diào)了；這暗示OsbZIP52/RISBZ5可能在寒冷和干旱中作為負調(diào)控因子[29]。同樣推測慈竹的這兩個基因也可能有類似功能。

在脅迫處理下，BebZIP2基因相對表達量下降的很快，很可能是由于它的啟動更快，使得它對脅迫非常敏感能夠迅速反饋給信號通路，從而減少它的表達量；而BebZIP6則相對滯后，使得它在初始條件下相對表達量較低，在脅迫處理下，對脅迫處理很敏感，為了適應環(huán)境的改變其相對表達量上升，待適應環(huán)境后又開始下降，為了穩(wěn)定持續(xù)地適應環(huán)境，它需要多次的調(diào)控其表達，來回的上下波動最終趨于恒定，這有助于提高慈竹對多種非生物脅迫的適應能力。這些推斷是否正確均需進一步實驗去驗證。

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