田新民 ，石蘭英，喬征磊，劉長海，王 淼

東北林蛙（Rana dybowskii）隸屬于蛙科林蛙屬，主要分布于中國亞寒帶的東北三省和內(nèi)蒙古自治區(qū)，是重要藥用價(jià)值林蛙油的主要來源，也具有較高的營養(yǎng)食用價(jià)值，為東北林區(qū)重要經(jīng)濟(jì)物種［1，2］。 近年來工農(nóng)業(yè)活動(dòng)，使土地和河水受到污染，特別是重金屬的污染［3］，被蛙類等生物體吸收和富集，通過食物鏈進(jìn)入人體，危害健康［4，5］。 因此有必要進(jìn)行蛙類棲息環(huán)境、養(yǎng)殖條件及食用部位重金屬評(píng)價(jià)領(lǐng)域的研究，而此領(lǐng)域主要集中在魚類的研究［3，6］。

關(guān)于東北林蛙的研究，近些年在雌性林蛙油和營養(yǎng)價(jià)值等領(lǐng)域進(jìn)行了深入研究，為林蛙保健食品的開發(fā)提供了重要的參考數(shù)據(jù)［7－10］，而對(duì)有害重金屬含量的分析鮮有報(bào)道。牡丹峰國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)距牡丹江市中心僅15 km，易受城市活動(dòng)的影響。該區(qū)域內(nèi)已開展多年的東北林蛙半人工養(yǎng)殖，同時(shí)建有林蛙儲(chǔ)存庫，是牡丹江市場(chǎng)重要的林蛙源。因此，有必要開展該地區(qū)東北林蛙重金屬評(píng)價(jià)的研究，為東北林蛙的合理養(yǎng)殖和食品開發(fā)利用提供重要參考。

1　材料與方法

1.1　研究地區(qū)概況

牡丹峰國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于黑龍江省牡丹江市區(qū)東南約15 km處，地處老爺嶺山脈西北端，東與太平嶺相接，西與張廣才嶺比鄰。以保護(hù)牡丹峰珍貴的山地云冷杉、紅松闊葉混交林及生物多樣性資源為目的，總面積194.68 km2。保護(hù)區(qū)內(nèi)有5種國家Ⅰ級(jí)和32種國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，也是東北林蛙的主要分布區(qū)，林蛙主要以半人工方式養(yǎng)殖。保護(hù)區(qū)內(nèi)的煙囪河為東北林蛙主要的越冬場(chǎng)所，是蛙卵人工孵化池的水源，并且中游段建有東北林蛙儲(chǔ)存庫［11，12］。

1.2　試驗(yàn)材料

于2016年4月，沿?zé)焽韬由?、中、下游附近?duì)冬眠出蟄后的東北林蛙進(jìn)行捕捉，同時(shí)取三個(gè)段位的河水備用分析。東北林蛙的體長與年齡密切相關(guān)，根據(jù)體長鑒定年齡［13］，將捕獲的林蛙測(cè)定體長（精確到0.01 mm），鑒定得到一齡、二齡、三齡個(gè)體（其中四齡個(gè)體較少，歸到三齡個(gè)體中分析）。因林蛙肌肉為人們常食用部位，故本研究僅以肌肉為分析樣本，解剖獲得腿部骨骼肌樣品備用。每個(gè)年齡段雌雄各10份樣品，共60份。

1.3　試劑與儀器

硝酸為高級(jí)純，過氧化氫為優(yōu)級(jí)純，標(biāo)準(zhǔn)品購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。7700 Series電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP－MS，Agilent Technologies），MDS－10 微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）。所用玻璃及聚四氟乙烯儀器均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上，然后用去離子水沖洗，晾干后備用。

1.4　微波消解法

稱取已處理的肌肉樣0.5 g置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入8 mL HNO3（65%～68%）預(yù)處理20 min，補(bǔ)加 2 mL HNO3和 1 mL H2O2（30%）消解。 消解條件：130℃ 25 min；150 ℃ 10 min；200 ℃ 25 min，單罐功率均為400 W。消解冷卻后，將聚四氟乙烯微波消解罐置于平板加熱器上除酸，最后用去離子水定容至25 mL。7700 Series ICP－MS測(cè)定重金屬濃度，最后換算為每千克肌肉樣品含多少毫克的元素。

1.5　數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選擇單因子方差分析（One－way ANOVA）進(jìn)行河水不同河段之間重金屬含量的差異顯著性檢驗(yàn)和不同年齡段間重金屬含量的差異顯著性檢驗(yàn)；應(yīng)用Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)重金屬與體長間、重金屬間的相關(guān)性；相關(guān)性顯著的，再利用線性回歸建立線性模型。采用Excel 2003作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　河水的重金屬評(píng)價(jià)

本研究對(duì)保護(hù)區(qū)內(nèi)東北林蛙越冬地的煙囪河上、中和下游河水重金屬含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，三段河水中 6 種元素 As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn 的平均含量分別為 0.291±0.012、0.003±0.001、0.309±0.046、0.005±0.002、0.435±0.026、0.005±0.002 μg／L，并且各元素含量三段河水間差異不顯著。與國家環(huán)境保護(hù)總局發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 3838－2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》五類地表水標(biāo)準(zhǔn)相比，河水中的6種重金屬含量均符合國家Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)，并且遠(yuǎn)低于Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)各元素的限量值。認(rèn)為東北林蛙棲息地水質(zhì)高于國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，該環(huán)境下所養(yǎng)殖的東北林蛙及其產(chǎn)品具有一定的安全性。

2.2　肌肉樣品的重金屬評(píng)價(jià)

捕獲并用于分析的東北林蛙體長為33.39～70.29 mm，平均為 55.478 mm；體重 3.157～39.045 g，平均為18.794 g。根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］按體長進(jìn)行年齡鑒定，共分出3個(gè)年齡段：一齡、二齡和三齡。重金屬含量分析，發(fā)現(xiàn)Cr含量二齡顯著高于一齡和三齡（P＜0.01），說明Cr在東北林蛙肌肉組織中富集能力較強(qiáng)。同時(shí)林蛙二齡達(dá)到性成熟，重金屬的代謝能力增強(qiáng)，可能導(dǎo)致Cr含量二齡顯著高于一齡和三齡［14］。其他元素含量各年齡段間無顯著差異，說明As、Cd、Pb、Cu、Zn在肌肉組織中無富集現(xiàn)象（圖1和圖2）。

As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn 六種元素的平均含量為0.028±0.020 5、0.004±0.003 06、0.087±0.110 5、0.682±0.486 8、0.731±0.108 5 和 5.198±1.761 6 mg／kg。綜合參考國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 2762－2012《食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)》、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5073－2006《無公害食品：水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》和GB 13106－1991《食品中鋅限量標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì) As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn的限量規(guī)定分別為 0.5、0.1、0.2、1.0、50、50 mg／kg。本研究的東北林蛙肌肉中的6種重金屬均未超標(biāo)，均達(dá)到了國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

圖1　不同年齡段個(gè)體肌肉As、Cd、Pb的含量

圖2　不同年齡段個(gè)體肌肉Cr、Cu、Zn的含量

2.3　體長與肌肉重金屬含量的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析，表明東北林蛙肌肉Cu含量與體長顯著正相關(guān)（r＝0.624，P＜0.05）；Cd 與 Pb 含量存在極顯著的正相關(guān)（r＝0.874，P＜0.01），其他元素間或與體長間均無相關(guān)性。說明林蛙一至三齡間肌肉Cu含量隨著年齡增長有增加趨勢(shì)，Cd與Pb含量具有一定的同源性。并對(duì)上述的正相關(guān)進(jìn)行了線性回歸，以建立線性模型。肌肉Cu含量與體長的線性關(guān)系為 Cu＝0.005 L＋0.436（R2＝0.389，P＜0.05）；Cd 與Pb含量的線性關(guān)系為 Cd＝0.024 Pb＋0.003 （R2＝0.765，P＜0.01）。

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