李世容，王龍，劉蕊，李玫，瞿浩，顧然，胡曉

(1貴州省人民醫(yī)院，貴陽550002；2皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院)

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，我國約有1 000萬癲癇患者，其中約30%為難治性癲癇[1]。研究顯示，脫髓鞘或脫髓鞘再生障礙在癲癇的發(fā)病中具有關(guān)鍵作用。我們的前期研究顯示，由少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)產(chǎn)生的髓鞘堿性蛋白(MBP)和髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)介導(dǎo)的脫髓鞘或髓鞘再生障礙與癲癇發(fā)作存在一定相關(guān)性[2]。但前期研究僅局限于癲癇發(fā)病后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的觀察，而對(duì)髓鞘相關(guān)蛋白在癲癇發(fā)作不同時(shí)期的具體表達(dá)情況未進(jìn)行深入研究。我們以癲癇大鼠模型為研究對(duì)象，探討髓鞘相關(guān)蛋白MBP、MAG在癲癇發(fā)作不同時(shí)期的變化情況，以期為臨床診療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

SPF級(jí)健康雄性12周齡SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。在溫度控制室內(nèi)飼養(yǎng)大鼠，晝夜各12 h，自由進(jìn)食、水。BL-420S型生物多媒體計(jì)算機(jī)刺激記錄系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，微型顱骨鉆、大鼠腦立體定位儀68505(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，雙極漆包鎳鉻電極(直徑0.1 mm、尖距0.025 mm，上海鼎皋公司)。RNAiso Plus、RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mixture試劑盒(大連TaKaRa公司)。

1.2　動(dòng)物分組與模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、假手術(shù)組各10只。正常組正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于大鼠腦立體定位儀，暴露顱骨及前囟。根據(jù)Konig圖譜確定大鼠右側(cè)杏仁核位置，于前囟后3.0 mm右側(cè)旁開4.8 mm顱骨表面下8.8 mm處插入電極固定。術(shù)后恢復(fù)1周，采用生物多媒體計(jì)算機(jī)刺激記錄系統(tǒng)刺激杏仁核行杏仁核點(diǎn)燃實(shí)驗(yàn)。刺激參數(shù)：細(xì)電流、串刺激、波寬1 ms，頻率60 Hz，持續(xù)時(shí)間1 s，強(qiáng)度0.450 mA，1次/d。每次電刺激停止時(shí)立即觀察大鼠癇性行為，采用視頻監(jiān)控記錄大鼠自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作情況。按Racine分級(jí)方法[5]進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。1級(jí)：面部陣攣，包括動(dòng)須，咀嚼等；2級(jí)：1級(jí)發(fā)作行為加節(jié)律性點(diǎn)頭；3級(jí)：2級(jí)行為加前肢陣攣；4級(jí)：3級(jí)行為加后肢站立；5級(jí)：4級(jí)行為加摔倒。4級(jí)及以上為成功誘發(fā)癲癇。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組各7只成功誘發(fā)癲癇。假手術(shù)組僅安裝電極不刺激杏仁核誘發(fā)癲癇。

1.3　干預(yù)方法

實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組誘發(fā)癲癇后均不再給予刺激。實(shí)驗(yàn)1組以誘發(fā)癲癇后至3 h作為癲癇急性驚厥發(fā)作期；實(shí)驗(yàn)2組以誘發(fā)癲癇后至30 d作為癲癇慢性驚厥發(fā)作期，觀察大鼠自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作情況。假手術(shù)組僅安裝電極不誘發(fā)癲癇。正常組正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù)。

1.4　標(biāo)本采集

正常組在正常飼養(yǎng)7 d，假手術(shù)組在安裝電極術(shù)后7 d，實(shí)驗(yàn)1組在誘發(fā)癲癇后3 h，實(shí)驗(yàn)2組在誘發(fā)自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作后30 d分別斷頭處死。用咬骨鉗咬合并逐漸暴露雙側(cè)大腦半球，快速取下大腦組織置于冰塊上，用眼科鑷子分離出新月形海馬組織。一部分海馬組織用于病理HE染色及MBP、MAG mRNA表達(dá)檢測；另一部分-80 ℃保存，用于MBP、MAG蛋白表達(dá)檢測。

1.5　海馬組織MBP、MAG mRNA表達(dá)檢測

采用RT-qPCR法。先用RNAiso Plus提取新鮮海馬組織樣本總RNA，用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Master Mixture試劑盒進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。以β-actin作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)并合成引物。引物序列：MBP上游5′-CCCATTGGTGCACACTAACCTC-3′，下游5′-CGACTTGATTCAGCGACAGGA-3′；MAG上游5′-GCGGCTACAACCAGTACACCTTC-3′，下游5′-CACCATGCAGCTGACCTCTACTTC-3′；β-actin上游5′-CTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。讀取基因擴(kuò)增的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MBP、MAG mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6　海馬組織MBP、MAG蛋白表達(dá)檢測

采用Western blotting法。將海馬組織從-80 ℃冰箱取出，迅速研磨成粉末。加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣于制好的SDS-PAGE上，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉-TBST封閉1 h后，加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST漂洗后Odyssey紅外成像儀掃描PVDF膜。采用的Image J和IPP6.0軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　海馬組織病理生理變化

正常組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞呈多層排列，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊緊密、分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多、外形規(guī)則；細(xì)胞層可分3～5層，胞核圓形或橢圓形，染色較淡，染色質(zhì)均勻，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，層次清晰，分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多、外形規(guī)則;細(xì)胞層可分3～5層，胞核圓形或橢圓形，染色較淡，染色質(zhì)均勻，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯。實(shí)驗(yàn)1組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較整齊緊密，胞核圓形或橢圓形，染色較淡，染色質(zhì)均勻，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯。實(shí)驗(yàn)2組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次變少，數(shù)量減少，排列紊亂、稀疏；部分神經(jīng)細(xì)胞核深染、固縮，呈桿狀或三角形，核仁不明顯，細(xì)胞周圍間隙增大。

2.2　各組海馬組織MBP、MAG mRNA表達(dá)水平比較

假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦海馬組織MBP、MAG mRNA表達(dá)均較正常組降低(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2組較假手術(shù)組降低(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組MBP、MAG mRNA表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，#P<0.05。

2.3　各組海馬組織MBP、MAG蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦海馬組織MBP、MAG蛋白表達(dá)均較正常組降低(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2組較假手術(shù)組降低(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組降低(P均<0.05)。見表2。

表2　各組MBP、MAG蛋白表達(dá)比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，#P<0.05。

3　討論

癲癇是大腦神經(jīng)元反復(fù)、無規(guī)律發(fā)作、同步異常放電導(dǎo)致腦功能紊亂的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有診斷困難、病情反復(fù)、治療效果較差等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量并增加患者及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前普遍認(rèn)為，脫髓鞘或髓鞘再生障礙在癲癇發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)髓鞘基因突變大鼠行為出現(xiàn)震顫和癲癇時(shí)，其腦電監(jiān)測可同時(shí)出現(xiàn)癲癇樣放電[4]，病理學(xué)可見腦組織有髓神經(jīng)纖維的數(shù)量及直徑減少，故認(rèn)為髓神經(jīng)纖維的變化可導(dǎo)致異常放電，從而誘發(fā)癲癇[5]。OL作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元髓鞘形成細(xì)胞，其成熟分化是中樞髓鞘形成的關(guān)鍵，OL分化異常嚴(yán)重影響OL正常功能，導(dǎo)致髓鞘脫失及有髓鞘神經(jīng)纖維減少影響電傳導(dǎo)，從而誘發(fā)癲癇。反復(fù)癲癇發(fā)作易產(chǎn)生驚厥性損傷，如得不到及時(shí)修復(fù)和控制，可形成局部病灶進(jìn)一步加重癲癇發(fā)作，提示OL分化異常與癲癇發(fā)作密切相關(guān)[6]。Reeves等[7]證實(shí)，癲癇患者腦組織中髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)降低與髓鞘脫失相關(guān)，且癲癇發(fā)作后存在OL增生及中樞神經(jīng)髓鞘脫失等病理變化，認(rèn)為OL在癲癇病理過程中發(fā)揮重要作用。因此,OL分化異常及髓鞘損傷與癲癇發(fā)作相關(guān)性值得關(guān)注。

OL分泌抑制性蛋白MBP、MAG。MBP是CNS髓鞘含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，約占髓鞘蛋白總量的1/3，位于髓鞘漿膜面。其與髓鞘膜帶負(fù)電荷的磷脂相互作用后緊密黏附結(jié)合，具有維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定、神經(jīng)傳導(dǎo)絕緣和快速傳導(dǎo)作用，并在OL髓鞘形成和分化成熟過程中扮演重要角色[8]。研究[9，10]表明，MBP在腦損傷、脫髓鞘疾病、缺血性腦血管病、神經(jīng)退行性疾病及慢性神經(jīng)性疼痛疾病中廣泛存在,可作為CNS相關(guān)性損傷標(biāo)志物。但癲癇發(fā)作后不同時(shí)期，腦組織中髓鞘相關(guān)蛋白的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化未見文獻(xiàn)報(bào)道。MAG是首先被發(fā)現(xiàn)的抑制髓鞘生長的蛋白，位于直接和軸突相接觸的髓鞘膜最里層,介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞與軸突及外周神經(jīng)系統(tǒng)的施萬細(xì)胞的相互作用參與髓鞘的形成，維持正常髓鞘化的神經(jīng)纖維穩(wěn)態(tài)、存活及降解，從而使腦內(nèi)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)神經(jīng)沖動(dòng)穩(wěn)定快速的傳導(dǎo)[11]。MAG也是髓鞘來源的神經(jīng)生長抑制因子的主要成分。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同階段，MAG顯示不同的功能，發(fā)育期促進(jìn)軸突生長，成熟期抑制軸突生長[12]。MBP mRNA主要是轉(zhuǎn)運(yùn)MBP蛋白與其相應(yīng)受體結(jié)合信號(hào)，介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜與軸突建立聯(lián)系，參與髓鞘形成過程[13]。MAG mRNA編碼MAG蛋白，MAG mRNA是髓鞘形成過程中最早出現(xiàn)的髓鞘特異性基因[14]，這些豐富的蛋白質(zhì)參與了軸突與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互連接和髓鞘形成，促進(jìn)神經(jīng)再生。

我們的前期研究[15]表明，癲癇患者致癲癇灶組織內(nèi)MBP陽性纖維明顯減少，反映成熟的OL功能障礙，但研究僅限于一個(gè)時(shí)期內(nèi)髓鞘蛋白的表達(dá)情況。癲癇海馬組織病變表現(xiàn)為CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次變少，數(shù)量減少，排列紊亂、稀疏，部分神經(jīng)細(xì)胞核深染、固縮，呈桿狀或三角形，核仁不明顯，細(xì)胞周圍間隙增大，上述表現(xiàn)在病程越長及發(fā)作更嚴(yán)重程度時(shí)更為明顯。本研究增加了對(duì)急性驚厥發(fā)作期及慢性驚厥發(fā)作期這兩個(gè)時(shí)段癲癇發(fā)作時(shí)海馬組織變化觀察，旨在進(jìn)一步闡述癲癇發(fā)作病程中髓鞘蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過程，最終找到與癲癇發(fā)作機(jī)制及髓鞘損害程度相適應(yīng)的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，各組MBP、MAG mRNA及蛋白表達(dá)均降低，說明癲癇的發(fā)病可使髓鞘相關(guān)蛋白基因明顯減少，從而抑制MBP、MAG蛋白的合成，進(jìn)一步支持癲癇的發(fā)生的確與髓鞘脫失有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組相比也出現(xiàn)上述變化趨勢，說明僅安裝電極不會(huì)引發(fā)癲癇發(fā)作，而刺激可以誘發(fā)及加重癲癇發(fā)作頻率。文獻(xiàn)[16]報(bào)道，癲癇患者及癲癇大鼠模型腦組織中MBP mRNA表達(dá)均明顯降低；而另一研究[17]則顯示在癲癇大鼠中MAG蛋白表達(dá)降低，MAG mRNA及MBP蛋白沒有明顯變化。本研究結(jié)果與其不一致，其原因可能與癲癇發(fā)作病程及病情嚴(yán)重程度不一致有關(guān)，且MBP貫穿于OL發(fā)育成熟的全過程，而MAG主要在成熟階段表達(dá)。實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組比較也有上述表達(dá)降低的現(xiàn)象出現(xiàn)，表明髓鞘損傷貫穿于癲癇發(fā)生的整個(gè)過程；且當(dāng)病程遷延時(shí)，脫髓鞘程度愈發(fā)嚴(yán)重。但兩者在癲癇發(fā)作過程中髓鞘蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，OL分化異常及相關(guān)基因的差異性表達(dá)在癲癇中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，癲癇發(fā)作大鼠腦海馬組織內(nèi)可出現(xiàn)明顯脫髓鞘反應(yīng)，即表現(xiàn)為OL產(chǎn)生的MBP及MAG蛋白表達(dá)下調(diào)，且病程越長，脫髓鞘反應(yīng)越嚴(yán)重。這可能是腦內(nèi)導(dǎo)致神經(jīng)纖維過度異常放電的原因之一，從而加重癲癇的發(fā)作。

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