李脈超，安普天，崔曉娟，朱文文，孟敏，張益萌，金利新

(1青島大學醫(yī)學部臨床醫(yī)學院，山東青島 266001；2青島大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系)

背根損傷是周圍神經(jīng)損傷的一種，損傷導致的部分感覺缺失可引起患者一系列的感覺和運動損傷癥狀。脊神經(jīng)背根損傷后，脊髓膠質(zhì)反應增強，脊髓后角神經(jīng)元凋亡丟失，相應脊髓節(jié)段神經(jīng)元失去了感覺信息傳入，從而引起患側(cè)感覺缺失和異常，嚴重影響患者生活和工作[1,2]。目前，臨床上對于脊神經(jīng)背根損傷的治療大多處于實驗階段，如自體神經(jīng)移植術及利用雪旺細胞、胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞來促進功能恢復[3,4]，但這些治療方法有一定的局限性[5]。運動訓練是一種可以提高神經(jīng)健康水平和促進功能恢復的輔助治療方式，近年受到越來越多研究者的關注[6,7]。運動訓練已廣泛應用到諸如腦卒中、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)損傷等神經(jīng)疾病康復領域，并取得的良好的效果。但目前運動訓練對于各種原因引起的背根損傷的應用效果仍是未知。本研究觀察了運動訓練對脊神經(jīng)背根損傷大鼠痛覺功能的影響，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量230～250 g，由青島市實驗動物和動物實驗中心提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，濕度55%±15%；自由飲食，給予充足的飼料和水，12 h光照交替。實驗過程符合動物實驗相關倫理要求。

1.2 主要試劑及儀器膠原纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、離子鈣接頭分子(Iba-1)單克隆抗體(美國Abcam公司)，二步法超敏試劑盒(中杉金橋公司)；ZH-PT型動物跑臺(淮北正華生物儀器有限公司)。

1.3 實驗動物分組、脊神經(jīng)背根損傷模型制備及運動訓練方法所有大鼠隨機分為3組各15只。訓練組及手術組均采用脊神經(jīng)背根神經(jīng)節(jié)切除術制備脊神經(jīng)背根損傷模型：將大鼠俯臥于手術臺上，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，常規(guī)備皮消毒。找到L4腰椎，沿后正中線偏右依次切開右側(cè)背部皮膚及皮下筋膜，分離棘突旁肌肉，顯現(xiàn)椎間孔，用咬骨鉗咬除L4椎體上下的關節(jié)突關節(jié)以擴大手術野。分離顯示背根神經(jīng)節(jié)，依次切斷并取出右側(cè)L3、L4脊神經(jīng)節(jié)，斷端間距2 mm。逐層消毒縫合切口。假手術組不制備模型，僅咬除相應關節(jié)突，分離至觀察到脊神經(jīng)，不損傷脊神經(jīng)。制模后每天肌肉注射青霉素4 萬U/只，連續(xù)注射3 d，預防感染。正常飲食，自然光照。訓練組于制模后7 d開始跑步訓練，大鼠在ZH-PT型動物跑臺上進行平板運動，速度為15 m/min，每隔5 min休息30 s，持續(xù)30 min，1次/d，共28 d。手術組與假手術組不進行跑臺訓練，自由活動。

1.4 大鼠痛覺閾值測定 采用北京拜安吉科技有限公司電子測痛儀Electric von-frey測定各組大鼠制模前1 d及制模1、7、14、21、28 d的痛覺閾值。將剛性測試頭安裝在探頭上，在大鼠脛骨中點處施加壓力，如果大鼠出現(xiàn)快速縮足或鳴叫，即為一次陽性反應，此時讀出電子控制器上的數(shù)值即為痛覺閾值。每只大鼠測量5次，每次測量間隔時間為10 min，去除最大值、最小值，取平均值。

1.5 大鼠脊髓后角Ⅱ板層GFAP、Iba-1檢測于制模7、14、28 d各組分別取5只大鼠，用4 ℃生理鹽水200 mL及4%多聚甲醛300 mL進行心臟灌注，然后取出L3、L4節(jié)段脊髓，放入4%多聚甲醛液中固定，3 d后進行常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片，切片厚度3 μm。一抗為GFAP單克隆抗體和Iba-1單克隆抗體，使用二步法超敏試劑盒做兩步法染色，DAB顯色，中性樹膠封片。在200倍顯微鏡下對患側(cè)脊髓后角拍照，拍照時設定相關拍攝參數(shù)，保證圖像獲取的一致性。使用Image-pro plus6.0軟件勾畫出脊髓后角Ⅱ板層，并將此區(qū)域設為AOI，獲取脊髓后角Ⅱ板層的OD值。

2　結果

2.1制模前后各組大鼠痛覺閾值比較見表1。

表1　制模前后各組大鼠痛覺閾值比較

注：與手術組比較，*P<0.05；與假手術組比較，△P<0.05；與同組制模前1 d比較，#P<0.05。

2.2各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層GFAP OD值比較結果見表2。

表2　　　　各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層GFAP OD值比較

注：與手術組比較，*P<0.05；與假手術組比較，△P<0.05；與同組制模7 d比較，#P<0.05。

2.3各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層Iba-1 OD值比較結果見表3。

表3　　　　各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層Iba-1 OD值比較

注：與手術組比較，*P<0.05；與假手術組比較，△P<0.05；與同組制模7 d比較，#P<0.05。

3　 討論

脊神經(jīng)背根損傷多是由于車禍、手術、分娩等損傷后引起神經(jīng)根受到牽拉，或出現(xiàn)脊柱損傷、骨折，從而使神經(jīng)根受壓甚至出現(xiàn)神經(jīng)根斷裂等原因所導致。脊神經(jīng)背根損傷臨床上常表現(xiàn)為患者感覺異?；騿适?、患側(cè)肢體無力等癥狀，甚至會出現(xiàn)病理性神經(jīng)疼痛，嚴重影響患者的感覺功能、運動功能和生活質(zhì)量。臨床常用的治療方式是通過手術對斷開的神經(jīng)進行縫合，或應用神經(jīng)營養(yǎng)藥物輔助治療[8]，但治療效果并不理想。如何促進感覺功能的恢復是目前研究的熱點。

神經(jīng)損傷康復是建立在神經(jīng)可塑性和功能重組的理論基礎上的。運動訓練作為一種康復方式，正是利用神經(jīng)細胞所具有的可塑性，進行不斷重復再學習的功能訓練，從而實現(xiàn)一定的功能恢復。運動訓練后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子尤其是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等增加[9]，可以在一定程度上促進中樞神經(jīng)的功能重塑。因此，運動康復訓練被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的康復過程中。

痛覺作為感覺的一種類型，可以在一定程度上反映感覺系統(tǒng)的恢復程度。本文結果顯示，脊神經(jīng)背根損傷斷后，手術組和訓練組痛覺閾值升高，之后隨時間推移逐漸降低，反映機體痛覺存在一定代償機制。即當某一節(jié)段的神經(jīng)節(jié)切除后，被切除神經(jīng)節(jié)所支配區(qū)域的皮膚仍然存在一定的感覺，這是由于此重疊神經(jīng)支配區(qū)域的其中一部分神經(jīng)節(jié)的軸突失去作用時，與之相競爭的相鄰神經(jīng)的背根神經(jīng)節(jié)起到維持該區(qū)域內(nèi)的感覺傳入作用[10,11]。而訓練組制模痛覺閾值的升高明顯低于手術組，提示運動訓練在脊神經(jīng)背根損傷后的早期就可以促進痛覺閾值的恢復。這可能與運動訓練能提高內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，促進相鄰節(jié)段脊髓內(nèi)神經(jīng)元的出芽，活化脊髓網(wǎng)絡，形成代償適應性的感覺傳導旁路來傳導感覺信息[12～14]有關。

另外，脊神經(jīng)背根損傷后，激活的膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化中發(fā)揮重要作用[15,16]，這也是代償適應性感覺傳導旁路形成的重要影響因素。有研究[17,18]表明，激活的膠質(zhì)細胞會延緩神經(jīng)通路的恢復和誘導非適應性的神經(jīng)重塑。GFAP被認為是星形膠質(zhì)細胞的標志物之一，其表達水平反映了膠質(zhì)細胞的激活和膠質(zhì)化的程度，并在一定意義上表明神經(jīng)細胞損傷的程度[19,20]。星形膠質(zhì)細胞的過度增生，可以使損傷局部產(chǎn)生瘢痕，阻止損傷神經(jīng)的初級神經(jīng)元軸突向遠端生長。Iba-1為小膠質(zhì)細胞活化的標志物之一，脊神經(jīng)背根損傷可使小膠質(zhì)細胞活化，活化后的小膠質(zhì)細胞主動吞噬組織碎片,分泌炎性介質(zhì)抑制軸突生長。有研究[21]表明，阻斷小膠質(zhì)細胞的激活及其活性物質(zhì)的釋放能顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛癥狀，說明星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞在感覺損傷后的修復過程中扮演著重要角色。本文結果顯示，手術組脊髓后角Ⅱ板層GFAP、Iba-1 OD值增加，這與損傷后感覺功能顯著下降相一致；訓練組GFAP、Iba-1 OD值低于手術組，說明運動訓練在一定程度上抑制了脊髓后角Ⅱ板層的膠質(zhì)反應，從而減少膠質(zhì)瘢痕形成，為脊髓突觸的形成以及突觸穩(wěn)定性提供一個相對積極的“允許”環(huán)境，有利于代償適應性感覺傳導旁路的形成。

總之，運動訓練可恢復脊神經(jīng)背根損傷大鼠的痛覺功能，機制可能與其可抑制脊髓后角Ⅱ板層GFAP、Iba-1表達有關。

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