周怡然，辛 宇，陳 駿

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 大連 116027)

小細(xì)胞肺癌(SCLC)是各種類型肺癌中惡性程度最高的腫瘤，約占所有肺癌的15%～20%，其5年生存率<6%[1-2]。過去幾十年中，SCLC的一線化療方案仍以順鉑或卡鉑加依托泊苷為主，盡管其暫時對放化療敏感，但很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3-5]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一種導(dǎo)致組織重塑的復(fù)雜的分子和細(xì)胞過程，通常作為腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥的機(jī)制被廣泛研究。所以我們需要更深入地了解SCLC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥的細(xì)胞和分子機(jī)制以改善目前治療方案?；趯CLC細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)更深的理解以及SCLC鼠模型的建立，潛在的治療靶點可能幫助人類克服SCLC治療上的困難[3]。本文將對Notch信號通路、ASCL1基因的表達(dá)與EMT的關(guān)系及其相關(guān)潛在治療靶點在SCLC治療中的新進(jìn)展作一綜述。

1 SCLC的EMT樣特征

1.1 EMT

EMT是指上皮細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附性丟失、重塑，失去上皮特征而獲得間質(zhì)細(xì)胞表象的生物現(xiàn)象。EMT不僅參與胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中亦發(fā)揮重要作用。EMT過程中主要轉(zhuǎn)錄因子包括Snail家族，堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(basic Helix-Loop-Helix，bHLH)家族成員Twist(Twist1，Twist2)和E盒結(jié)合鋅脂蛋白(ZEB1，ZEB2)；信號通路包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路、Notch信號通路、Wnt信號通路等[6]。EMT過程中，E-Cadherin/β-Catenin復(fù)合體的缺失是其發(fā)生標(biāo)志。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT不僅伴隨著分子相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的變化，而且還發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，從而使細(xì)胞獲得運(yùn)動、侵襲能力。

1.2 SCLC細(xì)胞特征與EMT

SCLC組織學(xué)特征之一是具有不成熟的外觀。SCLC細(xì)胞顯示：細(xì)胞低分化，無細(xì)胞器，細(xì)胞核呈圓形、紡錘形，染色質(zhì)分散、呈細(xì)顆粒狀，胞漿稀少，核仁缺乏或不明顯[7-8]；細(xì)胞間連接減少；具有不規(guī)則和不連續(xù)基底層的頂端極性喪失[7]；遠(yuǎn)離上皮結(jié)構(gòu)的圓形和梭形細(xì)胞； E-Cadherin表達(dá)降低，N-Cadherin表達(dá)增加[9]；偶發(fā)的偽足樣細(xì)胞質(zhì)過程和金屬蛋白酶(metal loprotease，ML)活性增強(qiáng)[10]。從EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)控的觀點來看，人SCLC細(xì)胞系比NSCLC細(xì)胞系顯示出更高的Snail，Slug和ZEB2的表達(dá)，并且這些轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)EMT。Dr.P?pper[11]報道了在NSCLC中，組織細(xì)胞成簇移動，而SCLC細(xì)胞在單細(xì)胞或小細(xì)胞簇移動中遷移。另外報道證實SCLC細(xì)胞模擬白細(xì)胞沿著血管壁滾動[12]。所有這些觀察結(jié)果都可以支持SCLC具有EMT樣特征。

2 Notch1信號通路與ASCL1

Notch1信號通路與ASCL1在EMT的調(diào)控中具有重要意義，Notch1信號通路可以通過Hes1基因調(diào)節(jié)ASCL1的轉(zhuǎn)錄，同時也可對ASCL1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[13],兩者相互作用共同調(diào)控SCLC EMT的發(fā)生。

2.1 Notch1信號通路在EMT中的意義

2.1.1 Notch1信號通路

Notch1是Notch信號通路中最常被檢測到的Notch受體家族成員。Notch1編碼一種相對分子質(zhì)量為300 kDa的跨膜蛋白受體，受體的胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)是Notch的活化形式，當(dāng)受體與配體結(jié)合時，Notch1受體經(jīng)過ML、腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶和γ-分泌酶復(fù)合物切割后，釋放其胞內(nèi)段的活性成分NICD，隨后，NICD進(jìn)入細(xì)胞核，其RAM區(qū)結(jié)合CSL蛋白并募集核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族MAML，形成轉(zhuǎn)錄激活子，從而激活下游基因[14]。

DLL3是Notch配體之一，同時也是ASCL1的直接下游靶點[15]。哺乳動物Notch家族配體DLL1、DLL4、JAG1和JAG2各自1激活Notch受體信號通路[16]。相反，DLL3主要定位于高爾基體，不能激活Notch信號[17]。在正常發(fā)育中，DLL3通過與Notch和DLL1相互作用并分別將其重新定位或保留到晚期溶酶體或高爾基體，從而阻止它們定位于細(xì)胞表面，抑制Notch信號通路的傳導(dǎo)[17-18]。因此，DLL3可能與神經(jīng)內(nèi)分泌表型有關(guān)，并有助于NET發(fā)生。在包括SCLC在內(nèi)的NET中，DLL3高度上調(diào)并在細(xì)胞表面異常表達(dá)，使其成為潛在的治療靶點[19]。

2.1.2 Notch1信號通路與EMT的關(guān)系

SCLC有很高的突變負(fù)荷。110例SCLC患者樣本的全基因組測序顯示，約25%的SCLC中Notch家族基因存在失活突變，表明這些基因是SCLC中腫瘤抑制因子[20]。有研究觀察到 Notch信號的激活導(dǎo)致SCLC轉(zhuǎn)基因小鼠模型中腫瘤明顯減少、存活時間延長，進(jìn)而支持了這一觀點[21]。H69是一種經(jīng)典的SCLC細(xì)胞系，顯示出沒有Notch1表達(dá)的神經(jīng)內(nèi)分泌分化，H69AR是一種表達(dá)Notch1而失去神經(jīng)內(nèi)分泌分化的化學(xué)耐藥變體，是一種變異的SCLC細(xì)胞系。通過H69 SCLC細(xì)胞的實驗研究揭示Notch信號通路在SCLC的細(xì)胞形態(tài)、粘附、運(yùn)動性和耐藥性中的意義[22-24]。H69細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)皿中，但是經(jīng)NICD基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈現(xiàn)出粘液生長模式。NICD誘導(dǎo)產(chǎn)生上皮標(biāo)志物如E-Cadherin和CD44，并減少EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail和Slug。此外，NICD轉(zhuǎn)染H69細(xì)胞系的異種移植腫瘤組織學(xué)顯示SCLC與腺癌混合組分。在體外基質(zhì)跨膜侵襲試驗中，抑制Notch基因表達(dá)的H69AR細(xì)胞的侵襲能力比對照組H69AR細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。

2.2 ASCL1在EMT調(diào)控中的作用

ASCL1是bHLH基因家族成員之一。ASCL1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，不僅在腫瘤的神經(jīng)內(nèi)分泌分化過程中起重要作用，而且通過誘導(dǎo)EMT，增加神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，SCNN1A編碼的上皮鈉離子通道α亞單位(the alpha subunit of theepithelial sodium channel，αENaC)與SCLC中ASCL1表達(dá)水平相關(guān)，即αENaC在ASCL1依賴型(ASCL1高表達(dá))SCLC中呈高表達(dá)狀態(tài)[25]。作為一種口服保鉀利尿劑，先前已有報道阿米洛利在多項生化和細(xì)胞分析研究以及動物模型研究中具有抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移功能[26-27]。為了確定αENaC抑制是否可以模擬ASCL1功能喪失效應(yīng)以降低細(xì)胞活力，研究測試了阿米洛利對H889 ASCL1高表達(dá)和H82 ASCL1低表達(dá)SCLC細(xì)胞和永生化HBEC3KT細(xì)胞活力的影響。隨著阿米洛利濃度的增加，H889細(xì)胞活力下降，但對H82或HBEC3KT細(xì)胞活性無影響[25]。因此我們可以推斷，SCNN1A/αENaC是SCLC種系特異性基因ASCL1的直接轉(zhuǎn)錄靶點，可運(yùn)用藥理學(xué)靶向進(jìn)行抗腫瘤作用。然而，此項研究目前僅處于基礎(chǔ)實驗階段，臨床研究還有待于進(jìn)一步開展。

2.2.1 ASCL1在SCLC的意義

SCLC是一種常見的NET，人體神經(jīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌組織的分化依賴于ASCL1的作用。Blges等[24]首先報道了ASCL1在鼠胚胎發(fā)育和人類SCLC神經(jīng)內(nèi)分泌分化中的意義。在鼠胚胎發(fā)育中敲除ASCL1基因，會導(dǎo)致肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的缺失。相反，在轉(zhuǎn)基因鼠中過表達(dá)ASCL1能夠促進(jìn)氣道上皮增生，ASCL1與SV40(simian virus 40)大T抗原共同轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺腫瘤形成[28]。

2.2.2 ASCL1誘導(dǎo)EMT的意義

ASCL1不僅可以促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌分化，還在腫瘤細(xì)胞的生長、存活、遷移和侵襲中發(fā)揮作用。SCLC細(xì)胞系中ASCL1的下調(diào)可抑制軟瓊脂上細(xì)胞克隆生長并誘導(dǎo)凋亡，其高表達(dá)可促進(jìn)NET的發(fā)生。此外，ASCL1可能通過改變CDK5/P35表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲[29]。綜合來看，ASCL1除了具有促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌的功能外，還可能參與癌細(xì)胞遷移，有助于SCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移。

人腺癌細(xì)胞系中ASCL1基因的轉(zhuǎn)染研究已有報道，并且在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中證實了具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化功能。關(guān)于EMT，Osada等[30]報道，ASCL1轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞顯示出一種變形蟲遷移表型，可能與E-Cadherin/β-Catenin復(fù)合體的缺失相關(guān)。當(dāng)用ASCL1基因轉(zhuǎn)染時，腺癌細(xì)胞喪失粘附性并漂浮在培養(yǎng)皿中。在ASCL1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，除神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)外，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail，Slug和ZEB2增加，而E-Cadherin降低。當(dāng)將ASCL1轉(zhuǎn)染的腺癌細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠的皮下組織中時，異種移植的腫瘤由小細(xì)胞和沒有上皮結(jié)構(gòu)的大細(xì)胞組成，表現(xiàn)出未分化的組織學(xué)特征。

3 DLL3抑制劑在臨床中的應(yīng)用

Rova-T(Rovalpituzumab tesirine)是一種新型DLL3的靶向性單克隆抗體和細(xì)胞毒藥物的耦聯(lián)物[31]。2015年歐洲醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)會(ESMO)會議上，Pietanza等[32]報告了79例接受一線或二線治療后進(jìn)展的SCLC患者接受Rova-T治療的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果，結(jié)果顯示約三分之二的SCLC患者DLL3高表達(dá)。Rova-T在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性SCLC和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌患者中首次進(jìn)行的人體Ⅰ期臨床試驗結(jié)果于2017年發(fā)表[33]。在65例可評估的患者中，17%有確切的療效反應(yīng)，54%疾病穩(wěn)定。中位隨訪時間為5.6個月(95%CI 2.5-8.3)，中位PFS為3.1個月(95%CI 2.7-4.1)，中位OS為4.6個月(95%CI 3.9-7.1)。DLL3高表達(dá)(定義為至少50%的腫瘤細(xì)胞中可檢測到蛋白表達(dá))的情況下，ORR為39%，疾病控制率(疾病穩(wěn)定或客觀反應(yīng))為89%。最值得注意的是，在具有可用于蛋白組織分析的患者中，僅可在具有高DLL3表達(dá)水平的那些患者中觀察到療效反應(yīng)，進(jìn)一步支持了Rova-T療效與DLL3表達(dá)水平相關(guān)的臨床前觀察[33]。在探索性分析中，DLL3高表達(dá)亞組的中位PFS為4.5個月(95%CI 3.0-5.4)，DLL3低表達(dá)亞組的中位PFS為2.3個月(95%CI 1.3-3.3)，但沒有報道DLL3高表達(dá)和DLL3低表達(dá)亞組之間的總存活率差異[33]。同時，通過I期臨床試驗結(jié)果，研究人員確定了II期試驗的推薦劑量和時間表(0.3 mg/kg，每6周1個周期)，并確定了劑量限制性毒性，包括血小板減少癥，肝功能異常和漿膜腔積液[33]。這些數(shù)據(jù)支持DLL3作為該療法的候選預(yù)測性生物標(biāo)志物，并且這些結(jié)果在預(yù)先治療的患者群體中似乎很有前景。然而，還需要進(jìn)一步的研究來確定Rova-T治療的臨床益處，并且有關(guān)該藥物的多項試驗也正在進(jìn)行中。

4 展 望

腫瘤細(xì)胞中還存在其他與EMT相關(guān)的誘導(dǎo)因子及其信號通路，此外，Notch1的表達(dá)在SCLC和NSCLC中表達(dá)的差異反應(yīng)了Notch信號通路在兩類腫瘤中具有復(fù)雜的作用機(jī)制，因此，深入的研究有助于揭示Notch信號通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系?；贏SCL1對NET高度的特異性和敏感性，ASCL1可能成為肺NET尤其是SCLC的臨床病理診斷標(biāo)志物。更值得期待的是，Notch1和ASCL1相關(guān)研究可能為SCLC提供更多的治療靶點，為SCLC患者帶來新的希望。

[1] Niho S, Kubota K, Yoh K, et al. Clinical outcome of small cell lung cancer with pericardial effusion but without distant metastases[J]. J Thorac Oncol, 2011, 6(4): 796-800.

[2] Govindan R, Page N, Morgensztern D, et al. Changing epidemiology of small-cell lung cancer in the United States over the last 30 years: analysis of the surveillance, epidemiologic, and end results database[J]. J Clin Oncol, 2006, 24(28): 4539-4544.

[3] Bunn PA Jr, Minna JD, Augustyn A, et al. Small cell lung cancer: can recent advances in biology and molecular biology be translated into improved outocome[J]. J Thorac Oncol, 2016, 11(4): 453-474.

[4] Pietanza MC, Byers LA, Minna JD, et al. Small cell lung cancer: will recent progress lead to improved outcomes?[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(10): 2244-2255.

[5] Rodriguez E, Lilenbaum RC. Small cell lung cancer: past, present, and future[J]. Curr Oncol Rep, 2010, 12(5): 327-334.

[6] Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(3): 178-196.

[7] Warren WH, Memoli VA, Gould VE. Immunohistochemical and ultrastructural analysis of bronchopulmonary neuroendocrine neoplasms.II. Well-differentiated neuroendocrine carcinomas[J]. Ultrastruct Pathol, 1984, 7(2-3): 185-199.

[8] Foulkes WD, Clarke BA, Hasselblatt M, et al. No small surprise-small-cell carcinoma of the ovary, hypercalcaemic type is a malignant rhabdoid tumour[J]. J Pathol, 2014, 233(3): 209-214.

[9] Fischer KR, Durrans A, Lee S, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is not required for lung metastasis but contributes to chemoresistance[J]. Nature, 2015, 527(7579): 472-476．

[10] Li XX, Li RJ, Zhao LJ, et al. Expression of molecular factors correlated with metastasis in small cell lung cancer and their significance[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(11):14676-14684.

[11] P?pper HH. Progression and metastasis of lung cancer[J]. Cancer Metastasis Rev,2016, 35(1): 75-91.

[12] Heidemann F, Schildt A, Schmid K, et al. Selectins mediate small cell lung cancer systemic metastasis[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e92327.

[13] Iso T, Kedes L, Hamamori Y. HES and HERP families: multiple effectors of the Notch signaling pathway[J]. J Cell Physiol, 2003, 194(3): 237-255.

[14] Haich JJ, Henkel T, Salmon P, et al. Truneated mamgnalian Notch1 activates CBF1/RBPJk-repressed genes by a mechanism resembling that of Epstein-Barr virus EBNA2[J]. Mol Cell Biol, 1996, 16(3): 952-959.

[15] Henke RM, Meredith DM, Borromeo MD, et al. Ascl1 and Neurog2 form novel complexes and regulate Deltalike3 (Dll3) expression in the neural tube[J]. Dev Biol, 2009, 328(2): 529-540.

[16] Ntziachristos P, Lim JS, Sage J, et al. From fly wings to targeted cancer therapies: a centennial for notch signaling[J]. Cancer Cell, 2014, 25(3): 318-334.

[17] Chapman G, Sparrow DB, Kremmer E, et al. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis[J]. Hum Mol Genet， 2011, 20(5): 905-916.

[18] Serth K, Schuster-Gossler K, Kremmer E, et al. O-fucosylation of DLL3 is required for its function during somitogenesis[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0123776.

[19] Saunders LR, Ban kovich AJ, Anderson WC,et al. A DLL3-targeted antibody-drug conjugate eradicates high-grade pulmonary neuroendocrine tumor-initiating cells in vivo[J]. Sci Transl Med，2015,7(302):302ra136.

[20] Kunnimalaiyaan M, Chen H. Tumor suppressor role of Notch-1 signaling in neuroendocrine tumors[J]. Oncologist 2007, 12(5): 535-542.

[21] George J, Lim JS, Jang SJ, et al. Comprehensive genomic profiles of small cell lung cancer[J]. Nature, 2015, 524(7563): 47-53.

[22] Wael HA, Yoshida R, Kudoh S, et al. Notch1 signaling controls cell proliferation, apoptosis and differentiation in lung carcinoma[J]. Lung Cancer, 2014, 85(2):131-140.

[23] Hassan WA, Yoshida R, Kudoh S, et al. Notch1 controls cell invasion and metastasis in small cell lung carcinoma cell lines[J]. Lung Cancer, 2014, 86(3): 304-310.

[24] Borges M, Linnoila RI, van de Velde, et al. An Achaete-Scute homologue essential for neuroendocrine differentiation in the lung[J]. Nature,1997,386(6627): 852-855.

[25] He M, Liu S, Callolu SK, et al. The Epithelial Sodium Channel (alphaENaC) Is a Downstream Therapeutic Target of ASCL1 in Pulmonary Neuroendocrine Tumors[J]. Transl Oncol, 2018,11(2):292-299.

[26] Matthews H, Ranson M, Kelso MJ. Anti-tumour/metastasis effects of the potassium-sparing diuretic amiloride: an orally active anti-cancer drug waiting for its call-of-duty?[J]. Int J Cancer, 2011,129(9): 2051-2061.

[27] Xu S, Liu C, Ma Y, et al. Potential roles of amiloride-sensitive sodium channels in cancer development[J]. Biomed Res Int, 2016,2016(2):1-6.

[28] Meder L, K?nig K, Ozretic′L, et al. NOTCH, ASCL1, p53 and RB alterations define an alternative pathway driving neuroendocrine and small cell lung carcinomas[J]. Int J Cancer, 2016, 138(4): 927-938.

[29] Demelash A, Rudrabhatla P, Pant HC, et al. Achaete-scutehomologue-1 (ASH1) stimulates migration of lung cancer cells through Cdk5/p35 pathway[J]. Mol Biol Cell, 2012, 23(15): 2856-2866.

[30] Osada H, Tomida S, Yatabe Y, et al. Roles of achaete-scutehomologue 1 in DDK and E-cadherin in repression and neuroendocrine differentiation in lung cancer[J]. Cancer Res, 2008, 68(6): 1647-1655.

[31] Tiberghien AC, Levy JN, Masterson LA, et al. Design and synthesis of tesirine, a clinical antibody-drug conjugate pyrrolobenzodiazepine dimer payload[J]. ACS Med Chem Lett, 2016, 7(11): 983-987.

[32] Bauer TM, Spigel D, Morgensztern D, et al. ORAL02.01: Safety and Efficacy of Single-Agent Rovalpituzumab Tesirine, a DLL3-Targeted ADC, in Recurrent or Refractory SCLC: Topic: Medical Oncology[J]. J Thorac Oncol, 2016,11(11S):S252-S253.

[33] Rudin CM,Pietanza MC, Bauer TM,et al. Rovalpituzumab tesirine, a DLL3-targeted antibody-drug conjugate, in recurrent small-cell lung cancer: a first-in-human, first-in-class, open-label, phase 1 study[J]. Lancet Oncol, 2017, 18(1):42-51.