陳璞 魏星

（青島第二中學(xué)，山東 青島 266000）

仿刺參（Apostichopua japordcu）是一種以底棲碎屑為食的海洋生物，分布于中國(guó)北方沿海的淺海地區(qū)，在食用、藥用、科研等方面都具有很高的價(jià)值，是中國(guó)重要的一種海水養(yǎng)殖種類。海參具有超強(qiáng)的再生能力，當(dāng)環(huán)境條件不適或遭遇敵害時(shí)，可自動(dòng)將腸道排出體外，隨后啟動(dòng)再生過程，在適宜的環(huán)境條件下很快再生出新的功能完善的腸道。因此，海參已成為研究消化道等內(nèi)臟器官形態(tài)發(fā)生過程的很好的動(dòng)物模型［1-2］。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），革蘭氏陽性，屬于硬壁菌門，芽孢桿菌屬，是一種乳酸菌。該菌細(xì)胞呈桿狀，端生芽孢，無鞭毛。凝結(jié)芽孢桿菌可有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，改良腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)腸道發(fā)育，增強(qiáng)腸道功能。在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可提高飼料品質(zhì)，促進(jìn)飼料的消化吸收，降低料重比；可有效改善人體由于應(yīng)激、過敏反應(yīng)引起的菌群失調(diào)性腹瀉；無任何毒副作用，使用安全，并可降低環(huán)境中的氨氣、硫化氫等有害氣體，改善養(yǎng)殖環(huán)境，屬于益生菌。

有關(guān)仿刺參腸道再生期的細(xì)菌群落對(duì)其腸道再生影響的研究至今未見報(bào)道［3］。仿刺參排臟后需要在最短的時(shí)間內(nèi)再生出消化系統(tǒng)，以維持其生命活動(dòng)，而其腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)也在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生演替，并對(duì)其腸道正常功能的恢復(fù)起著重要的作用［4-5］。仿刺參腸道再生的過程，也是其整個(gè)腸道內(nèi)細(xì)菌群落重建的過程。在其他學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌（另一種益生乳酸菌）對(duì)海參腸道的再生有非常明顯的促進(jìn)作用［6-7］。因此，研究其腸道再生期細(xì)菌群落的重建，特別是益生菌對(duì)其腸道再生的作用機(jī)理以及對(duì)其腸道功能的恢復(fù)有著非常重要的理論和實(shí)踐意義［8］。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用仿刺參取自青島膠南近海海域，為養(yǎng)殖基地中自然環(huán)境下生長(zhǎng)的3個(gè)月齡個(gè)體，個(gè)體質(zhì)量約20 g，體長(zhǎng)（自然狀態(tài)下）4～5 cm。仿刺參暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室水槽內(nèi)，飼養(yǎng)用水為近海沙濾自然海水，鹽度為30～32，pH值為7.6～8.1，投喂人工配合飼料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)海參吐臟。準(zhǔn)備體長(zhǎng)4～5 cm的健康仿刺參幼苗，向每只仿刺參幼苗尾部注射少量KCl（1mol/L）誘導(dǎo)其吐臟（見圖1），將吐臟1d后仍活性良好的仿刺參幼苗放入適宜濃度的卡那霉素、氯霉素殺菌液中浸泡20s（見圖2）。

圖1 吐臟的仿刺參幼苗

圖2 將吐臟后的仿刺參幼苗放入殺菌液中浸泡

表1 仿刺參幼苗的培養(yǎng)條件

1.2.2 分組培養(yǎng)。將吐臟殺菌后的仿刺參幼苗分成6組，每組6只，其中包括3組試驗(yàn)組和3組對(duì)照組（見表1），進(jìn)行參體表滅菌后放入試驗(yàn)裝置中飼養(yǎng)（見圖3），并立即在試驗(yàn)組水體中加入凝結(jié)芽孢桿菌（原液105～106個(gè)/mL），在飼養(yǎng)過程中定期投喂滅菌飼料。

圖3 將仿刺參幼苗在試驗(yàn)裝置中分組培養(yǎng)

1.3 取樣

加入芽孢后每隔1 d取水樣進(jìn)行細(xì)菌涂布培養(yǎng)試驗(yàn)，測(cè)定裝置水體中細(xì)菌情況。加入芽孢5 d后，在試驗(yàn)組和對(duì)照組中各取6只海參樣本，取其腸道，測(cè)定腸道內(nèi)淀粉酶、蛋白酶消化活性［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體細(xì)菌情況

在試驗(yàn)組中加入凝結(jié)芽孢后，4 d內(nèi)水體中的燦爛弧菌數(shù)目平均增長(zhǎng)數(shù)相比對(duì)照組明顯小很多（見圖4），但凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)弧菌外的細(xì)菌抑菌作用并不明顯（見圖5）。但是，經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)后，試驗(yàn)組與對(duì)照組的弧菌與其他細(xì)菌增長(zhǎng)數(shù)均沒有顯著差異（見表2、3）。

圖4 水體內(nèi)燦爛弧菌數(shù)目變化

圖5 6組水體內(nèi)其他細(xì)菌數(shù)目變化

表2 弧菌增長(zhǎng)情況

表3 其他細(xì)菌增長(zhǎng)情況

2.2 仿刺參腸道內(nèi)消化酶活性情況

用分光度計(jì)測(cè)得，加入芽孢后第5天仿刺參的腸道消化酶（淀粉酶、蛋白酶）活性明顯高于未加入芽孢的對(duì)照組（見圖6和圖7），且經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)后，兩組檢驗(yàn)結(jié)果均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表4、5）。

圖6 加入芽孢后第5天仿刺參腸道內(nèi)淀粉酶活性

圖7 加入芽孢后第5天仿刺參腸道內(nèi)蛋白酶活性（透光率T）

表4 仿刺參腸道內(nèi)淀粉酶活性

表5 仿刺參腸道內(nèi)蛋白酶活性

2.3 誤差分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，測(cè)定海參腸道內(nèi)消化酶活性的試驗(yàn)較成功。加入芽孢后5 d內(nèi)，試驗(yàn)組與對(duì)照組的消化酶活性有顯著差異。但在測(cè)定水體菌落情況時(shí)，弧菌增長(zhǎng)數(shù)的測(cè)定結(jié)果與假設(shè)不符，筆者認(rèn)為這是試驗(yàn)誤差所致。此外，本試驗(yàn)無法顯示水體中的其他菌種是否參與了海參再生期間再生腸道的構(gòu)建。

因試驗(yàn)操作時(shí)間是8月中下旬，由于水體溫度過高，在養(yǎng)殖基地采集的仿刺身幼苗樣本可能已經(jīng)進(jìn)入夏眠，腸道可能發(fā)生了一定程度的退化［10］。但筆者認(rèn)為，整個(gè)試驗(yàn)過程均將水體溫度控制在15℃左右，這是海參最適宜的生長(zhǎng)溫度，不會(huì)再產(chǎn)生很大的誤差。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)海水中的弧菌起到較好的抑菌作用，且能明顯促進(jìn)仿刺參再生期間新腸道的構(gòu)建。本試驗(yàn)研究仿刺參的腸道再生期細(xì)菌群落的重建，為益生菌對(duì)仿刺參腸道再生的作用機(jī)理以及對(duì)其腸道功能的恢復(fù)提供了非常重要的理論和實(shí)踐支持，為以后的水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的益生菌研究提供了良好的試驗(yàn)依據(jù)。

［1］皮玉麟.中國(guó)動(dòng)物志：棘皮動(dòng)物門：海參綱［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］鄭法新，孫修勤，張進(jìn)興.刺參吐臟再生的組織學(xué)研究［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2006（1）：134-139.

［3］常亞青，隋錫林，李俊.刺參增養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀、存在問題與展望［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2006（4）：198-201.

［4］張春云，陳國(guó)福，徐仲，等.海參疾病學(xué)研究進(jìn)展［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2011（10）：644-648.

［5］李杰.患病仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及有益菌的篩選與應(yīng)用［D］.青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2013.

［6］于明超，李卓佳，文國(guó)樑.芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中的研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（11）：78-81.

［7］周海平，李卓佳，楊鸞鸞，等.乳酸桿菌LH對(duì)幾種水產(chǎn)養(yǎng)殖病原弧菌的抑制作用［J］.應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào)，2006（3）：388-395.

［8］莫照蘭，徐懷恕.益生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.海彈科學(xué)，1998（6）：6-9.

［9］任慶印，潘魯青.刺參消化酶性質(zhì)與活性分布的研究［J］.海洋湖沼通報(bào)，2013（2）：51-56.

［10］胡凡光，高翔，王志剛，等.刺參休眠規(guī)律的研究［J］.漁業(yè)現(xiàn)代化，2011（2）：37-40.