羊布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)方法對(duì)比試驗(yàn)

阿力米古麗·烏米爾哈孜

（新疆塔城地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心，塔城 834700）

0 引言

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌感染引起的一種急慢性人畜共患病。除感染羊和人類外，還可危害牛、豬等動(dòng)物。該種致病菌對(duì)妊娠動(dòng)物造成的危害嚴(yán)重，其他動(dòng)物感染該種致病菌后不會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，很難在較短時(shí)間內(nèi)作出診斷，很難及時(shí)對(duì)病情做出診斷，當(dāng)出現(xiàn)典型臨床癥狀后，表示病情已經(jīng)嚴(yán)重傳播流行。由于布魯氏桿菌病屬于國(guó)家二類動(dòng)物傳染性疫病，同時(shí)也是一種人畜共患病，確診后，在做好患病羊撲殺處理同時(shí)，還應(yīng)做好羊群凈化處理。而在對(duì)患病羊進(jìn)行診斷和羊群凈化處理過(guò)程中，通常選擇使用虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行針對(duì)性診斷，逐步凈化羊群，培育無(wú)病羊群。為進(jìn)一步探討上述2種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，研究主要在3個(gè)規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)分3個(gè)批次采集了3 000份新鮮血液，進(jìn)行血清學(xué)檢查，對(duì)比2種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率和靈敏度。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料選取

羊血清主要采自于新疆塔城地區(qū)3個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，共分3個(gè)批次進(jìn)行集中采集，共采集3 000份，將采集到的新鮮血液帶回實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)方法分離得到血清，-20 ℃低溫保存。研究選擇的虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原和陽(yáng)性血清、試管凝集試驗(yàn)抗原和陽(yáng)性血清，均來(lái)自于青島易邦生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為獸藥字（2011）150138017和（2011）150138011。

1.2 方法

首先，血液采集和血清制備。分3個(gè)批次在新疆塔城地區(qū)3個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)采集羊的新鮮血液。采集時(shí)，先將羊保定，將靜脈表皮的羊毛消毒剔除后，采集靜脈新鮮血液。血液采樣后，用標(biāo)記筆在采血器上注明對(duì)應(yīng)的羊耳標(biāo)號(hào)，除去針頭后放置在保溫箱內(nèi)保存，及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行離心處理，得到上層血清，血清制備完成后，放置于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存[1]；其次，虎紅平板凝集試驗(yàn)。虎紅平板凝集試驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，使用標(biāo)記筆，在滅菌干凈的玻璃板上編號(hào)，用移液器吸取30 μL虎紅平板凝集抗原，然后分別吸取采集到的血清30 μL，與虎紅平板凝集抗原混合均勻，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，如果待檢血清出現(xiàn)顆?；蛐鯛钗锬卸殛?yáng)性，完全不凝集判定為陰性[2]；再次，試管凝集試驗(yàn)。試管凝集試驗(yàn)操作也需要嚴(yán)格按照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，對(duì)試管標(biāo)記，向第1個(gè)標(biāo)記好的試管內(nèi)添加1.15 mL的稀釋液，剩余的試管中可添加0.5 mL的稀釋液，使用移液器，在第1個(gè)試管中加入待檢血清0.1 mL，用移液器連續(xù)吹打5～6次，混合均勻后，吸取0.25 mL混合液舍去，再吸取0.5 mL混合液，加入到第2個(gè)試管，按照上述方法混合均勻，再吸入第3個(gè)試管，混合液0.5 mL，依次稀釋到第4個(gè)試管。確保試管稀釋度分別為1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100，然后再向試管中添加20倍稀釋的抗原稀釋液，每個(gè)試管中添加0.5 mL，充分震蕩混合均勻，確保血清稀釋度控制在1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、抗原對(duì)照組，并配制比濁管振搖均勻。將全部的試管放置在37 ℃保溫箱內(nèi)，持續(xù)培養(yǎng)24 h，取出試管后記錄檢查結(jié)果，以比濁管為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，對(duì)比上層液體的清亮程度?！?+”表示完全凝集，全部下沉，上層液體100%清澈；“3+”表示幾乎凝集，上層液體100%清澈；“2+”表示顯著凝集，上層液體50%清澈；“+”表示有沉淀，上層液體25%清澈；“-”表示無(wú)沉淀，液體均勻陰性[3]；最后，靈敏度對(duì)比試驗(yàn)。為有效檢測(cè)上述2種方法的靈敏度，將虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的血清分別進(jìn)行虎紅平板凝集和試管凝集交叉試驗(yàn)，驗(yàn)證第1次檢測(cè)出陽(yáng)性血清的2種方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 虎紅平板凝集與試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比

通過(guò)使用虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，對(duì)3 000份血清分別進(jìn)行檢測(cè)，其中第1個(gè)批次的513份羊血清中虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)出13份，試管凝集試驗(yàn)共檢出陽(yáng)性血清12份，檢出率分別為2.53%、2.34%。第2批1 269份羊血清中虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)出16份，試管凝集試驗(yàn)共檢出陽(yáng)性血清17份，檢出率分別為1.26%、1.34%。第3批1 218份羊血清中虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)出14份，試管凝集試驗(yàn)共檢出陽(yáng)性血清16份，檢出率分別為1.15%、1.31%，見(jiàn)表1。

表1 虎紅平板凝集試驗(yàn)與虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比

2.2 虎紅平板凝集與試管凝集試驗(yàn)靈敏度對(duì)比

將第1次檢測(cè)為陽(yáng)性的血清分別進(jìn)行其他2種檢測(cè)方法再次檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，第1次虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的50份陽(yáng)性血清，試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)45份全部為陽(yáng)性，有5份為陰性。試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的45份陽(yáng)性血清中經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)，45份全部呈陽(yáng)性。由此可知2種檢測(cè)方法以試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度更高，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中可能存在假陽(yáng)性。

3 結(jié)束語(yǔ)

羊布魯氏桿菌病檢測(cè)過(guò)中應(yīng)用較為常見(jiàn)的檢測(cè)方法主要為虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)2種。通過(guò)本次檢測(cè)結(jié)果可知，虎紅平板凝集試驗(yàn)的檢出率高于試管凝集試驗(yàn)，總體檢出率分別為1.67%和1.50%。為進(jìn)一步驗(yàn)證2種檢測(cè)方法的靈敏度，將上述2種方法第1次檢測(cè)出來(lái)的陽(yáng)性血清分別再進(jìn)行交叉檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的50份陽(yáng)性血清中，有45份陽(yáng)性，5份陰性。試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的45份血清中應(yīng)用虎紅平板凝集試驗(yàn)再次檢測(cè)，全部為陽(yáng)性，由此可知虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)存在假陽(yáng)性，其靈敏度相對(duì)于試管凝集試驗(yàn)較低。但由于該種檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性，因此可以將其作為初步羊布魯氏桿菌陽(yáng)性血清篩選檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，然后將篩選出來(lái)的陽(yáng)性血清進(jìn)行試管凝集排除假陽(yáng)血清，將2種方法有效結(jié)合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。

在今后羊布魯氏桿菌檢測(cè)時(shí)應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況，選擇合適的檢測(cè)手段，將虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)有效結(jié)合，極大提高防控質(zhì)量，提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，減少疾病傳播蔓延。