于宗霞

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

青蒿素是一種含有內(nèi)過氧橋的倍半萜內(nèi)酯，是治療瘧疾的有效成分，需求量極大[1]。目前，通過化學(xué)全合成、合成生物學(xué)進(jìn)行青蒿素的體外合成，步驟復(fù)雜、成本較高，距離產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用還有一定距離。野生青蒿(黃花蒿)仍是青蒿素的唯一來源，但植株中青蒿素含量低，僅占干重的0.1%～0.8%[2]。因此，通過基因工程手段提高植株中青蒿素含量具有重要意義。

青蒿素生物合成途徑已經(jīng)基本清晰：首先，法尼基焦磷酸（FDP）被紫穗槐－4,11－二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）催化環(huán)化生成紫穗槐－4,11－二烯[3]；接著，細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP71AV1，催化紫穗槐二烯依次形成青蒿醇、青蒿醛，最終得到青蒿酸[4]。一個(gè)雙鍵還原酶，DBR2，催化青蒿醛的△11,13位生成二氫青蒿醛[5]；青蒿醛、二氫青蒿醛進(jìn)一步被乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase ALDH）氧化成青蒿酸、二氫青蒿酸。但后續(xù)如何生成青蒿素尚無明確報(bào)道，推測(cè)可能是通過非酶促光氧化反應(yīng)。該途徑大部分的酶定位于青蒿腺毛的兩個(gè)頂端細(xì)胞中，推測(cè)青蒿素在這些細(xì)胞中起始合成[6]。

相比于青蒿素合成途徑解析以及微生物代謝工程改造方面取得的成績(jī)[7,8]，青蒿素內(nèi)源合成調(diào)控方面的報(bào)道還很少。青蒿素作為植物長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，其合成首先受到各種環(huán)境因子的影響，體外施加各種激素或者光處理，可以模擬植物生存環(huán)境的變化，激活體內(nèi)相應(yīng)信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控青蒿素的合成。如水楊酸和茉莉酸可以激活下游的AaWRKY和AaERF等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控青蒿素合成途徑關(guān)鍵酶基因ADS和CYP71AV1的表達(dá)水平，最終促進(jìn)青蒿素的合成[9,10]，藍(lán)光受體AtCRY1可以響應(yīng)光信號(hào)，從而影響青蒿素合成[11]。植物激素除了響應(yīng)外界生長(zhǎng)環(huán)境，還與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密不可分，赤霉素（GA）促進(jìn)種子萌發(fā)，生長(zhǎng)和開花，而脫落酸（ABA）則抑制這些生長(zhǎng)發(fā)育過程[12]，植物細(xì)胞的全能性和再生能力受到細(xì)胞分裂素(CTK)和生長(zhǎng)素(auxin)的共同調(diào)控[13]，茉莉酸（JA）促進(jìn)雄蕊的正常發(fā)育[14]，乙烯（ETH）在促進(jìn)光形態(tài)建成和植物的成熟衰老過程中發(fā)揮重要作用[15]。

青蒿素需求量大，價(jià)格昂貴(USD300～600/kg)，但青蒿中青蒿素含量極低。最近的臨床研究表明，食用干燥的青蒿葉片比服用單體青蒿素的藥效高40倍，健康人群飲用青蒿茶可以預(yù)防瘧疾[16]，暗示青蒿中其他次生代謝產(chǎn)物有增強(qiáng)青蒿素活性和藥效的功能。因此通過研究激素和光照對(duì)青蒿素合成的影響，在采收之前可以通過添加適當(dāng)?shù)募に鼗蚬庹?，從而提高青蒿素的產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料：

青蒿（Artemisia annua L.）野生栽培品系QT源自四川??；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）；SYBR? Premix Ex TaqTM.（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa）；脫氧核苷酸引物（Sangon，上海）。

1.2 方法：

1.2.1 植物RNA提取

取0.1 g植物材料于液氮中充分成細(xì)粉。移入1.5 mL離心管中，加入0.5 mL Trizol（Invitrogen，Cat.15596-018）混勻，室溫放置5 min；加入100 μL三氯甲烷充分混勻后1200 0rpm冷凍離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇沉淀RNA。12000 rpm冷凍離心10 min，沉淀用75%酒精洗滌，真空干燥，溶于 20～50 μL H2O (RNase free)。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄及定量分析

取1 g植物總RNA為模板依據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后作為定量分析的模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），使用表1中的引物對(duì)不同基因的表達(dá)量進(jìn)行Q-RT PCR檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9稀釋度）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以青蒿的AaACTIN（EU531837）作為內(nèi)標(biāo)參考，基因（X）表達(dá)量以X/Actin2表示。數(shù)據(jù)分析采用Rotor-Gene（Corbett Research，NSW，Australia）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取各組數(shù)據(jù)的平均值和方差，繪制圖表。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

用于Q-RT PCR檢測(cè)的青蒿素合成途徑酶基因ADS（AJ 25171），CYP7（EU684540），DBR2（EU704257）和內(nèi)參基因AaACTIN的引物序列如表1所示。

表1 Q-RT PCR使用的基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿素合成途徑酶基因表達(dá)的組織特異性

有報(bào)道青蒿素含量在開花之前達(dá)到頂峰，暗示青蒿素的合成在花期最為旺盛。選取青蒿的不同組織，如花（F）、嫩葉（NL）、老葉（OL）、莖（S）和根（R），分別在這5組植物樣本中檢測(cè)青蒿素合成途徑酶基因的表達(dá)水平，ADS、CYP71AV1和DBR2這三個(gè)酶基因在花序中均有較高水平的表達(dá)（圖1），與青蒿素含量在開花之前最高的報(bào)道吻合，說明青蒿素的合成具有時(shí)空特異性，與青蒿素的生長(zhǎng)階段密切相關(guān)，即生殖生長(zhǎng)階段含量豐富。

圖1 青蒿素合成途徑酶基因的組織表達(dá)特異性

2.2 激素對(duì)青蒿素合成的影響

青蒿素是青蒿在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，它的合成會(huì)受到外界環(huán)境影響。在實(shí)驗(yàn)室中通過激素以及不同波長(zhǎng)的光照來模擬外界環(huán)境的變化，通過該研究，可以在高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因青蒿植株采收之前，對(duì)植物進(jìn)行大批量的施加激素或者光照處理，從而達(dá)到進(jìn)一步提高青蒿素含量的目的。

圖2 激素SA、MeJA處理后青蒿素合成途徑酶基因表達(dá)水平

圖3 激素ABA、GA處理后青蒿素合成途徑酶基因表達(dá)水平

圖4 不同濃度激素IAA處理后青蒿素合成途徑酶基因表達(dá)水平。IAA-1到IAA-4依次代表IAA處理濃度為0.03、0.3、3和 30μM。

SA和MeJA處理青蒿后，檢測(cè)基因表達(dá)可見MeJA處理后，ADS、CYP71AV1和DBR2的轉(zhuǎn)錄水平均有明顯提高，其中ADS的表達(dá)水平受MeJA誘導(dǎo)顯著，SA處理后，僅ADS和CYP71AV1的轉(zhuǎn)錄水平提高，DBR2無明顯變化（圖2）。后續(xù)分別用50M的赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）（圖3）以及不同濃度的生長(zhǎng)素（IAA，低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)）（圖4）進(jìn)行處理，操作方法同SA和MeJA的處理。選取葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明不同激素對(duì)青蒿素合成途徑酶基因的表達(dá)水平都有一定的影響，其中ABA和特定濃度的生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)效果要明顯一些。

2.3 光照對(duì)青蒿素合成的影響

植物次生代謝產(chǎn)物的合成還會(huì)受到光照的影響，如光的波長(zhǎng)和光強(qiáng)等，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，分別將長(zhǎng)勢(shì)類似的1個(gè)月大的青蒿小苗放在正常光照、暗室和紅光下（640±20 nm，15 umol·m-2·s-1）處理8小時(shí)后，選取葉片進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果表明：暗處理抑制青蒿素合成途徑酶基因的表達(dá)，紅光則會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)（圖5）。

圖5 青蒿素合成途徑酶基因?qū)馓幚淼捻憫?yīng)

3 討論

從青蒿素合成途徑酶基因的組織表達(dá)特異性可見，基因的表達(dá)水平在花序中較高，與青蒿素合成在開花之前達(dá)到最高的報(bào)道吻合，說明青蒿素的合成具有時(shí)空特異性，青蒿素的合成與植物生長(zhǎng)階段相關(guān)，即在生殖生長(zhǎng)時(shí)期合成旺盛，暗示青蒿素的合成可能受到年齡因子的調(diào)控。

此外，青蒿素作為一種次生代謝產(chǎn)物，其合成還受到環(huán)境因子的影響，我們通過施加激素和不同波長(zhǎng)的光照來模擬環(huán)境的變化，MeJA、ABA、一定濃度的IAA和紅光都會(huì)提高青蒿素合成途徑酶基因的表達(dá)水平。激素除了作為環(huán)境因子的響應(yīng)信號(hào)途徑外，也參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，從這個(gè)層面上說，環(huán)境和年齡是兩個(gè)不可分割的因子，共同影響了青蒿素的合成。本研究主要從激素和光照角度闡釋環(huán)境對(duì)青蒿素合成的影響，從而為找出誘導(dǎo)青蒿素合成的方法打下基礎(chǔ)，可以于青蒿采收之前施加，達(dá)到短期進(jìn)一步提高青蒿素產(chǎn)量的目的。