商二磊， 隋正紅， 劉 源， 米 萍， 闕 州

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽 (Dimethylsulfoniopropionate, DMSP) 是一種重要的生源硫化物，也是海洋生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)硫的重要組成部分[1-2]。海洋藻類、細(xì)菌、珊瑚和一些高等植物均能生物合成DMSP[3-8]。一些細(xì)菌和藻類產(chǎn)生的裂解酶能將DMSP裂解成二甲基硫(Dimethylsulfide, DMS)[9-11]。DMS是海水中含量豐富的還原態(tài)生源硫化物[12]，當(dāng)海水中的DMS達(dá)到高度飽和狀態(tài)時(shí)，其通過海氣交換進(jìn)入大氣，參與全球的硫循環(huán)。在大氣中，DMS能氧化成非海鹽硫酸鹽和甲磺酸，這些氧化產(chǎn)物可參與云凝結(jié)核的形成，增加云的覆蓋度，進(jìn)而改變太陽對(duì)地球的輻射，最終影響地球的熱平衡[13]。海洋中的DMSP有著重要的生態(tài)意義，且對(duì)硫的生物地球化學(xué)循環(huán)有著重要的影響[14]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，DMSP在浮游植物中具有抗氧化、作為甲基供體、滲透壓調(diào)節(jié)、冷凍保護(hù)和保持細(xì)胞代謝平衡等多種功能[15-18]。

營養(yǎng)條件對(duì)海洋浮游植物的生長和新陳代謝過程起著至關(guān)重要的作用，也是影響DMSP合成的重要因素之一。目前已經(jīng)研究的主要包括氮、磷、硅和鐵元素對(duì)海藻產(chǎn)DMSP的影響，但氮元素的影響更為顯著[19]。作為浮游植物生長必須的一種元素，N是生物機(jī)體有機(jī)大分子如核酸和蛋白質(zhì)的重要組成元素，其缺乏將限制海洋初級(jí)生產(chǎn)力[20]。氮元素濃度影響海藻DMSP的產(chǎn)生，Wilson等通過圍隔實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氮元素限制能引起藻細(xì)胞DMSP產(chǎn)量顯著增加[21]。Keller等研究發(fā)現(xiàn)，顆石藻(Emilianianuleyi) 在氮元素充足的條件下，細(xì)胞DMSP含量顯著下調(diào)[22]；Kettles等對(duì)海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)的研究發(fā)現(xiàn)，氮元素的限制能顯著增加藻細(xì)胞內(nèi)DMSP含量[23]，Bucciarelli等在研究中也發(fā)現(xiàn)氮限制能引起海鏈藻中DMSP產(chǎn)量增加[19]。

甲藻是一類具有鞭毛和甲板的浮游植物，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中初級(jí)生產(chǎn)力的重要貢獻(xiàn)者[24]。鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumcatenella)是引發(fā)中國近岸赤潮的種類之一，由其引起的赤潮也廣泛分布于世界各海域。鏈狀亞歷山大藻能產(chǎn)生麻痹性貝毒，可被貝類積累，通過食物鏈最終影響人類的健康[25]。

作為一種重要的硫化物，有關(guān)DMSP功能的研究主要集中在硅藻上，而甲藻中相關(guān)研究卻是十分匱乏的。本文報(bào)告了氮限制的鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞的生理狀態(tài)和DMSP產(chǎn)生之間的關(guān)系，探究DMSP在鏈狀亞歷山大藻中的功能，為進(jìn)一步揭示DMSP在赤潮生消中的作用奠定基礎(chǔ)。另外，甲藻中以甲硫氨酸為起始物合成DMSP過程中相關(guān)基因的研究還未見報(bào)道，Kocsis和Rhodes等研究發(fā)現(xiàn)銅胺氧化酶(Copper amine oxidase)類可能是植物中參與DMSP合成的一個(gè)特異的關(guān)鍵酶[26-27]。我們從鏈狀亞歷山大藻的轉(zhuǎn)錄組(SRX368254)的注釋結(jié)果中檢索到功能注釋為銅胺氧化酶的兩條unigene基因，分別命名為cad-1(登錄號(hào)KY930889)和cad-2(登錄號(hào)KY930890)，研究其基因表達(dá)與DMSP產(chǎn)量的關(guān)系，為甲藻中DMSP合成相關(guān)途徑的構(gòu)建提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料的培養(yǎng)

鏈狀亞歷山大藻，保存于中國海洋大學(xué)藻種室。在無菌的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度(20±1)℃，光暗周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為30 μmol·m-2·s-1 [28]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鏈狀亞歷山大藻進(jìn)行同步化處理[29]，隨后將處理過的藻細(xì)胞以6×106cells/L的密度接種至無菌的f/2培養(yǎng)基和氮限制的f/2培養(yǎng)基(NaNO3的終濃度是正常的f/2培養(yǎng)基的1/20)中，在如上條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后的第1、3、5、7和9天取樣，以正常f/2培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞濃度和體積的測(cè)定 將魯哥氏液加到取樣藻液中，使其終濃度為2%。吸取樣品到Sedgewick-Rafter S52 計(jì)數(shù)板中(取樣前搖勻樣品)，在Olympus BX53顯微鏡下計(jì)數(shù)[30]。用移液器吸取20 μL魯哥氏液固定的藻液至載玻片上，將載玻片置于Nikon eclipese 80i顯微鏡下，用NIS-Elements軟件隨機(jī)測(cè)量50個(gè)細(xì)胞的大小，然后根據(jù)公式將線性長度轉(zhuǎn)化為藻細(xì)胞的體積[31]。

1.2.2 活性氧(ROS)含量的測(cè)定 使用活性氧測(cè)定試劑盒(南京建成公司)測(cè)定細(xì)胞中ROS水平。具體步驟如下：收集1×106個(gè)藻細(xì)胞于干凈的EP管中，向其中加入DCFH-DA(2, 7-dichlorofuorescin diacetate)，使其終濃度為15 μmol/L，混勻后將其置于37 ℃條件下處理30 min。將EP管在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清，再用PBS緩沖液重懸藻細(xì)胞，重復(fù)3次，最后將藻細(xì)胞置于熒光酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光強(qiáng)度，其中熒光酶標(biāo)儀的激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm，以單位細(xì)胞的熒光值表示ROS含量[32]。

1.2.3 光合能力的測(cè)定 根據(jù)Maxwell等的方法[33]，用Dual-PAM-100葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定藻細(xì)胞的光合能力。通過離心收集約5×106個(gè)藻細(xì)胞先在室溫(20 ℃)下暗適應(yīng)10 min，打開測(cè)量光，由測(cè)量光激發(fā)細(xì)胞葉綠素的本底熒光(Original fluorescence, Fo)，加以記錄。然后打開飽和脈沖光，熒光快速上升到最大值，獲取最大熒光(Maximum fluorescence, Fm)，光系統(tǒng)Ⅱ的最大光合作用量子產(chǎn)量反映了植物潛在的最大光合能力，根據(jù)公式Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm計(jì)算獲得。光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際量子產(chǎn)量反映了植物的實(shí)際光合能力，根據(jù)公式Y(jié)(Ⅱ) = (Fm’-F)/Fm’計(jì)算得出，其中Fm’是測(cè)量光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光。

1.2.4 DMSP濃度的測(cè)定 總DMSP的測(cè)定是在pH≥13的條件下將DMSP裂解成DMS，通過測(cè)定DMS含量間接求得DMSP含量。使用氣相色譜法測(cè)定DMS含量[34]，步驟為：將100 μL的50%的硫酸加入10 mL的藻細(xì)胞樣品中，對(duì)其進(jìn)行固定，黑暗條件下，室溫放置24 h。取處理過的樣品2 mL于10 mL樣品瓶中，向其中加入200 μL的10 mol·L-1KOH，迅速封閉瓶口，黑暗條件下室溫放置24 h后測(cè)定。測(cè)定過程分為吹掃-冷凝富集和加熱解析2個(gè)階段，具體為用40 mL/min的高純氮?dú)獯祾?，吹出的DMS通過含無水CaCl2的干燥管干燥后，在浸于液氮的捕集管中富集3 min，然后將捕集管放入熱水浴(>90 ℃)中加熱解析，通過載氣將DMS氣體送入裝有火焰光度檢測(cè)器的GC-2014氣相色譜儀(SHIMADZU, 日本)中進(jìn)行測(cè)定分析。根據(jù)總DMSP/藻細(xì)胞總體積的方式計(jì)算細(xì)胞DMSP的濃度[35]。

1.2.5 熒光定量PCR 使用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)提取鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞的總RNA，用DNase I(TaKaRa)消化DNA后，電泳檢測(cè)RNA的完整性，用Nano Drop 2000檢測(cè)其濃度和質(zhì)量，選取質(zhì)量合格的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)制備cDNA。使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。所用引物見表1，cad-1和cad-2基因熒光定量PCR的擴(kuò)增引物分別為qp-cad-1S/qp-cad-1A和qp-cad-2S/qp-cad-2A，gapdh和actin為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物分別為gapdhS/gapdhA和actinS/actinA。實(shí)驗(yàn)前作標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，防止對(duì)熒光定量PCR過程造成干擾。使用SYBR I試劑盒(Roche)在Light Cycler?480ⅡPCR熒光定量?jī)x上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL，其中cDNA 1 μL，SYBR I 10 μL，正反引物的終濃度為0.5 μmol/L，剩余體積用無菌ddH2O補(bǔ)充，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法[36]進(jìn)行計(jì)算。

表1 熒光定量PCR使用的引物信息Table 1 The information of primers used in quantitative real-time PCR

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)中每組處理均設(shè)置3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著性差異水平P= 0.05； 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析(Pearson)，顯著性差異水平P= 0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 藻細(xì)胞濃度的變化

藻細(xì)胞的濃度隨時(shí)間的變化見圖1。對(duì)照組中細(xì)胞濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而快速增加，第9天達(dá)到最大值為(1.87±0.04×107) cells/L。氮限制組中細(xì)胞濃度緩慢增加，于第7天達(dá)到最大值為(1.04±0.03×107)cells/L，然后下降，第9天細(xì)胞濃度降至(0.92±0.02×107)cells/L。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，從第1～9天，氮限制組細(xì)胞濃度均顯著性低于對(duì)照組(P<0.05)。

(星號(hào)表示同一取樣點(diǎn)的兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異。Asterisk indicated significant differences between same sampled point.)

圖1 對(duì)照組和氮限制組中鏈狀亞歷山大藻的生長曲線
Fig.1 The growth curve ofA.catenellafor control and nitrogen limitation

2.2 細(xì)胞體積的變化

細(xì)胞體積的變化見圖2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中，其它取樣點(diǎn)細(xì)胞體積相比第1天無顯著變化(P>0.05)。在氮限制組中，相比第1天，細(xì)胞體積在第3天無顯著變化(P>0.05)，第5～9天細(xì)胞的體積顯著增加(P<0.05)。相比對(duì)照組，氮限制組藻細(xì)胞體積在第1天和第3天無顯著變化(P>0.05)，第5～9天均顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明，氮限制能引起鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞體積的顯著增加。

(不同字母表示同一取樣點(diǎn)上的兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異，星號(hào)表示同一培養(yǎng)基中其它取樣點(diǎn)相對(duì)第一個(gè)取樣點(diǎn)之間存在顯著差異。Different letters indicated significant differences between control and nitrogen limited group at the same time. Asterisk indicated significant differences between other sampled point and day 1 under same nutrient condition.)

圖2 對(duì)照組和氮限制組中鏈狀亞歷山大藻的細(xì)胞體積
Fig.2 Cell volume ofA.catenellafor control and nitrogen limitation

2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化

ROS含量變化見圖3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中，相比第1天，其它取樣點(diǎn)ROS含量無顯著變化(P>0.05)。在氮限制組中，相比第1、3天ROS含量無顯著變化(P>0.05)，從第5～9天，藻細(xì)胞的ROS含量均顯著增加(P<0.05)。相比對(duì)照組，氮限制組中第1、3天細(xì)胞的ROS未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，從第5～9天，藻細(xì)胞中ROS含量均顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明，氮限制能引起鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞中ROS含量的顯著增加。

2.4 光合作用能力的變化

藻細(xì)胞Fv/Fm和Y(Ⅱ)的變化情況分別見圖4、5。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中，相比第1天，其它取樣點(diǎn)藻細(xì)胞的Fv/Fm無明顯變化(P>0.05)。在氮限制組中，相比第1、3天Fv/Fm無顯著變化(P>0.05)，第5～9天藻細(xì)胞的Fv/Fm是顯著降低的(P<0.05)。相比對(duì)照組，氮限制組細(xì)胞的Fv/Fm在第1天到第3天無顯著變化(P>0.05)，在第5～9天是顯著降低的(P<0.05)。對(duì)照組和氮限制組的藻細(xì)胞的Y(Ⅱ)的變化情況和Fv/Fm是一致的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氮限制下鏈狀亞歷山大藻的光和作用能力是顯著降低的。

(不同字母表示同一取樣點(diǎn)上的兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異，星號(hào)表示同一培養(yǎng)基中其它取樣點(diǎn)相對(duì)第一個(gè)取樣點(diǎn)之間存在顯著差異。Different letters indicated significant differences between control and nitrogen limited group at the same time. Asterisk indicated significant differences between other sampled point and day 1 under same nutrient condition.)

圖3 對(duì)照組和氮限制組中鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞活性氧含量
Fig.3 ROS levels ofA.catenellafor control and nitrogen limitation

(不同字母表示同一取樣點(diǎn)上的兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異，星號(hào)表示同一培養(yǎng)基中其它取樣點(diǎn)相對(duì)第一個(gè)取樣點(diǎn)之間存在顯著差異。Different letters indicated significant differences between control and nitrogen limited group at the same time. Asterisk indicated significant differences between other sampled point and day 1 under same nutrient condition.)

圖4 對(duì)照組和氮限制組中鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞的Fv/Fm
Fig.4Fv/FmofA.catenellafor control and nitrogen limitation

(不同字母表示同一取樣點(diǎn)上的兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異，星號(hào)表示同一培養(yǎng)基中其它取樣點(diǎn)相對(duì)第一個(gè)取樣點(diǎn)之間存在顯著差異。Different letters indicated significant differences between control and nitrogen limited group at the same time. Asterisk indicated significant differences between other sampled point and day 1 under same nutrient condition.)

圖5 對(duì)照組和氮限制組鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞Y(Ⅱ)
Fig.5Y(II) ofA.catenellafor control and nitrogen limitation

2.5 DMSP濃度的變化

藻細(xì)胞DMSP濃度的變化見圖6。統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中其它取樣點(diǎn)藻細(xì)胞DMSP濃度相比第1天無顯著變化(P>0.05)；在氮限制組中，相比第1天，第3～9天的藻細(xì)胞的DMSP濃度均顯著增加(P<0.05)。相比對(duì)照組，氮限制組中藻細(xì)胞DMSP濃度從第3～9天均顯著增加(P<0.05)，但在第1天較對(duì)照組無顯著變化(P>0.05)。藻細(xì)胞的DMSP濃度和ROS含量的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Pearson相關(guān)性系數(shù)r= 0.83(P<0.05)，這表明二者之間具有強(qiáng)相關(guān)性。

(不同字母表示同一取樣點(diǎn)的2組數(shù)據(jù)間存在顯著差異，星號(hào)表示同一培養(yǎng)基中其它取樣點(diǎn)相對(duì)第一個(gè)取樣點(diǎn)間存在顯著差異。Different letters indicated significant differences between control and nitrogen limited group at the same time. Asterisk indicated significant differences between other sampled point and day 1under same nutrient condition.)

圖6 對(duì)照組和氮限制組中鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞的DMSP濃度
Fig.6 DMSP concerntration ofA.catenellafor control and nitrogen limitation

2.6 基因表達(dá)水平的變化

使用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)cad-1和cad-2基因在氮限制的鏈狀亞歷山大藻中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，每個(gè)取樣點(diǎn)上以正常f/2培養(yǎng)基作對(duì)照，計(jì)算氮限制下基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果見圖7。相比對(duì)照組，氮限制下cad-1基因在第1天時(shí)的表達(dá)量無顯著變化，從第3～7天cad-1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，分別是對(duì)照的5.89、4.63和4.79倍，但在第9天其表達(dá)檢測(cè)不到。相比對(duì)照組，氮限制下cad-2基因在第1天的表達(dá)量未發(fā)生顯著變化；在第3、5天分別相比對(duì)照組上調(diào)了的19.29、19.26倍；第7、9天檢測(cè)不到其表達(dá)。

(星號(hào)表示差異顯著，三角形表示檢測(cè)不到基因的表達(dá)。Asterisk indicate significant difference, triangle represents the expression of gene can not be monitored.)

圖7 氮限制下鏈狀亞歷山大藻中基因cad-1和cad-2的相對(duì)表達(dá)量

Fig.7 Relative expressions of genecad-1andcad-2 ofA.catenellaunder nitrogen limitation

3 討論

營養(yǎng)鹽是影響海洋浮游植物DMSP合成的重要因素[19,37-38]。本文首次在鏈狀亞歷山大藻中檢測(cè)到DMSP產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)該藻能產(chǎn)生高濃度的DMSP(濃度約在10-1mol·L-1數(shù)量級(jí))，是海洋中DMSP的高產(chǎn)藻。研究了氮限制對(duì)鏈狀亞歷山大藻合成DMSP的影響，結(jié)果表明，氮鹽限制能顯著增加鏈狀亞歷山大藻中DMSP 的合成。已有的研究也發(fā)現(xiàn)了氮限制能增加海洋中浮游植物DMSP的產(chǎn)量[23,37]，如Kettles 等發(fā)現(xiàn)，在氮限制的條件下，海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)胞內(nèi)DMSP濃度顯著增加[23]，這與本研究的結(jié)果是一致的。

Bucciarelli等認(rèn)為，硅限制引起T.pseudonana藻細(xì)胞體積顯著增加是由于細(xì)胞分裂受到抑制導(dǎo)致的，因?yàn)楣柙厥枪柙寮?xì)胞壁的組成成分，硅限制導(dǎo)致胞壁合成受限，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂[19]。本研究結(jié)果顯示，氮限制能引起鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞體積的顯著增加，與此同時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增長緩慢，且在第9天出現(xiàn)下降，這表明氮限制抑制了細(xì)胞的分裂?？梢娂?xì)胞重要元素的缺乏可阻止浮游植物細(xì)胞的分裂，導(dǎo)致細(xì)胞體積增加。另外，Wang等發(fā)現(xiàn)，光合作用的抑制能降低細(xì)胞分裂的速度[39]，在本實(shí)驗(yàn)中，氮限制下藻細(xì)胞的光合作用是顯著降低的，這是細(xì)胞分裂受限的另一個(gè)佐證。本研究中，氮限制下藻細(xì)胞體積顯著增加，藻細(xì)胞體積的增加要求其保持胞內(nèi)滲透壓的平衡[32]，但是氮限制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中含氮滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)含量(甜菜堿和脯氨酸)下降，而細(xì)胞DMSP濃度在氮限制下是顯著升高的。藻體中的DMSP一般以兩性離子形式存在，其難以透過細(xì)胞膜，能在細(xì)胞內(nèi)積累，在海洋浮游植物中具有滲透壓調(diào)節(jié)功能[40]。因此推測(cè)DMSP在鏈狀亞歷山大藻中可能具有滲透壓調(diào)節(jié)的作用，有利于保持藻細(xì)胞體積增大時(shí)的滲透壓平衡。這進(jìn)一步驗(yàn)證了前人有關(guān)DMSP具有滲透壓調(diào)節(jié)功能的發(fā)現(xiàn)。

作為海洋中重要的生源硫化物，DMSP在浮游植物中具有抗氧化的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DMSP及其分解產(chǎn)物(包括DMS、DMSO、丙烯酸鹽和甲基磺酸)能與活性氧發(fā)生反應(yīng)，在藻細(xì)胞中具有抗氧化的功能[17]。本研究的結(jié)果顯示，氮限制能引起鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞ROS含量顯著增加，細(xì)胞DMSP濃度在此期間也是顯著增加的。馬金華等研究發(fā)現(xiàn)，鏈狀亞歷山大藻在低氮條件下，細(xì)胞中的可溶性蛋白含量顯著下降，丙二醛(MDA)和H2O2含量顯著增加，表明氮限制能引起細(xì)胞的氧化壓力增加[41]。這與本實(shí)驗(yàn)中氮限制引起細(xì)胞活性氧含量增加的結(jié)果是一致的。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藻細(xì)胞DMSP濃度和細(xì)胞ROS含量之間是高度相關(guān)的，推測(cè)DMSP在鏈狀亞歷山大藻中具有抗氧化的作用。本部分結(jié)果驗(yàn)證了DMSP在海洋浮游植物中具有抗氧化的功能。

氮限制能引起藻細(xì)胞活性氧含量的顯著增加，是因?yàn)椋旱谝?，氮限制可?dǎo)致細(xì)胞中富含氮元素的抗氧化酶(如抗壞血酸過氧化物酶)含量減少[42]。第二，氮限制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中修復(fù)氧化損傷的酶的合成受阻[43]。第三，光合系統(tǒng)中參與光捕獲、電子傳遞和CO2固定的蛋白均富含氮元素[19]，氮限制能引起細(xì)胞代謝平衡被打破，從而細(xì)胞引起細(xì)胞活性氧水平的增加[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，氮限制下細(xì)胞中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的濃度是下降的[44]，且Rubisco活性與光合作用電子傳遞能力的比例也是降低的[45]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氮限制下的藻細(xì)胞光合作用顯著下降，細(xì)胞的活性氧水平顯著升高，這上述觀點(diǎn)是一致的。

Sunda等發(fā)現(xiàn)，CO2限制能引起海鏈藻的氧化壓力顯著增加，且DMSP含量和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性均是顯著增加的，Sunda等認(rèn)為細(xì)胞中DMSP和APX共同發(fā)揮作用，以清除細(xì)胞中過量的活性氧，因?yàn)槎呔芘c活性氧發(fā)生反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞活性氧含量顯著增加時(shí)，DMSP濃度也是顯著增加的；馬金華等對(duì)鏈狀亞歷山大藻研究發(fā)現(xiàn)，氮限制能引起藻細(xì)胞中還原型谷胱甘肽(GSH)含量下降[41]，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞處于氧化脅迫時(shí)，GSH作為抗氧化保護(hù)劑被消耗?？梢姰?dāng)鏈狀亞歷山大藻處于氧化壓力時(shí)，細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)和DMSP都發(fā)揮著清除活性氧的功能，這與Sunda等的發(fā)現(xiàn)一致。

值得注意的是，氮限制的藻細(xì)胞在第3天DMSP濃度是顯著增加的，而活性氧和細(xì)胞體積卻未發(fā)生顯著變化。這可能是因?yàn)镈MSP是一種多功能的有機(jī)硫化物，其不僅具有抗氧化、滲透壓調(diào)節(jié)這些功能，還在其它方面發(fā)揮作用，如保持細(xì)胞代謝平衡和作為甲基供體等，但這需要相關(guān)的研究加以證實(shí)。

赤潮是一種有害的生態(tài)現(xiàn)象，其發(fā)生是生物、物理和化學(xué)等多種因素共同作用的結(jié)果，不同海域的赤潮生物和影響因子也不盡相同，這是赤潮機(jī)理復(fù)雜的原因所在。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈狀亞歷山大藻是一種能產(chǎn)生DMSP的赤潮甲藻，且DMSP在藻體中可能發(fā)揮著抗氧化和滲透壓調(diào)節(jié)等抗逆功能。本研究為赤潮研究提供一個(gè)新的視角，因?yàn)镈MSP作為一種多功能的有機(jī)化合物能協(xié)助浮游植物應(yīng)對(duì)不良的環(huán)境脅迫，以更好的生存。

海洋浮游植物是DMSP的主要生產(chǎn)者，盡管高等植物和大型綠藻中有關(guān)DMSP的合成途徑已進(jìn)行了研究[27,46]，但甲藻中與DMSP合成的基因研究還未見報(bào)道。本研究選取一個(gè)可能參與DMSP合成的關(guān)鍵酶——銅胺氧化酶，在氮限制下研究其基因表達(dá)與DMSP產(chǎn)量的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氮限制下基因cad-1的相對(duì)表達(dá)量在第1天未發(fā)生顯著變化，第3～7天的相對(duì)表達(dá)量顯著增加，第9天檢測(cè)不到。相比對(duì)照，氮限制下藻細(xì)胞DMSP濃度在第1天未發(fā)生顯著變化，DMSP濃度在第3～9天均顯著增加，但是第9天的DMSP濃度相比第7天出現(xiàn)了顯著的下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第1～7天，氮限制的鏈狀亞歷山大藻中基因cad-1表達(dá)量和DMSP濃度的變化是一致的，在第9天二者不一致。測(cè)定的生理指標(biāo)表明，氮限制的藻細(xì)胞在第9天已處于嚴(yán)重的氧化脅迫之下，cad-1基因在這種脅迫下的轉(zhuǎn)錄受到限制導(dǎo)致此時(shí)檢測(cè)不到其表達(dá)；氮限制下的藻細(xì)胞第9天DMSP濃度仍顯著高于對(duì)照組，可能是之前產(chǎn)生的DMSP未被過度消耗，因?yàn)橄啾鹊?天，第9天DMSP濃度已出現(xiàn)顯著的降低。從第1～5天，氮限制下基因cad-2的相對(duì)表達(dá)量與cad-1是一致的，但在第7、9天，cad-2基因的表達(dá)也檢測(cè)不到。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cad-1與cad-2基因可能都參與了鏈狀亞歷山大藻中DMSP的合成，且發(fā)揮不同的作用，這些都需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié)語

本文研究了氮限制下鏈狀亞歷山大藻的細(xì)胞濃度、體積、活性氧含量、光合作用能力和DMSP含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氮限制能引起鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞DMSP濃度的顯著增加，氮限制下的藻細(xì)胞處于氧化脅迫之下。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活性氧水平和DMSP濃度之間具有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，這表明DMSP在細(xì)胞中具有抗氧化的作用。另外，DMSP在鏈狀亞歷山大藻中可能也發(fā)揮著滲透壓調(diào)節(jié)的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了前人有關(guān)藻細(xì)胞中DMSP功能的發(fā)現(xiàn)。本文首次探究了DMSP在鏈狀亞歷山大藻中的生理功能，為甲藻中深入研究DMSP的功能提供參考；本研究首次在甲藻中探究與DMSP合成相關(guān)的基因，為甲藻中DMSP合成相關(guān)途徑的構(gòu)建提供一定的參考。

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