周祖陽， 李 琪， 于 紅， 孔令鋒

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

Fem-1(Ferminazation-1)基因最早是在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的研究中被發(fā)現(xiàn)，并且在其性別決定通路中發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用。該基因不但對(duì)雄性體組織具有致雄化作用，還可以對(duì)雄性和雌雄同體個(gè)體中的雄性生殖細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用[1-4]。在秀麗隱桿線蟲的性別決定通路中，F(xiàn)em基因既可以負(fù)調(diào)控下游的Tra-1基因，又受到了上游Tra-2和Tra-3的負(fù)調(diào)控[5-7]。除了線蟲以外，F(xiàn)em-1基因家族也在人類、小鼠和斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)[8-11]。截止目前的研究表明，F(xiàn)em-1基因家族包含F(xiàn)em-1a，F(xiàn)em-1b和Fem-1c三個(gè)基因，盡管這3個(gè)基因的具體功能還不明確，但是它們編碼的氨基酸序列存在一定的相似性而且在脊椎動(dòng)物和線蟲之間存在一定的保守性。由此推測(cè)脊椎動(dòng)物中Fem-1基因的功能可能與線蟲相似，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[12]。迄今，雙殼貝類中Fem-1基因的研究目前僅在長牡蠣基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究中有所報(bào)道[13]。

長牡蠣(Crassostreagigas)又稱太平洋牡蠣，隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)瓣鰓綱(Lamellivranchia)翼形亞綱(Pterimorphia)珍珠貝目(Pterioida)牡蠣科(Ostridae)巨蠣屬(Crassostrea)。作為我國優(yōu)良的海水養(yǎng)殖貝類，長牡蠣具有抗逆性強(qiáng)、體型大、生長速度快、營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，具有重要的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)已成為我國北方牡蠣養(yǎng)殖的主要品種。然而，長牡蠣在繁殖過程中存在很多特殊的繁殖生理現(xiàn)象，比如性逆轉(zhuǎn)和雌雄同體等現(xiàn)象。截止目前，這些現(xiàn)象的機(jī)理還不清楚，長牡蠣性別決定和分化機(jī)制還不明確[13-15]。本文通過RACE技術(shù)和熒光定量技術(shù)對(duì)長牡蠣Fem-1b和Fem-1c兩個(gè)基因進(jìn)行克隆并且利用采集的周年樣品和不同胚胎發(fā)育時(shí)期的樣品進(jìn)行表達(dá)分析。通過本研究，旨在為長牡蠣性腺發(fā)育的分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2015年5月—2016年4月每月在齊東路水產(chǎn)市場(chǎng)購買來自乳山海域的長牡蠣20～25個(gè)。對(duì)樣品進(jìn)行解剖得到一部分性腺組織保存于波恩氏液中固定24 h，經(jīng)過數(shù)次酒精洗滌后最終保存于70%酒精溶液中等待組織切片的制作，用于觀察確定樣品所處的性腺發(fā)育時(shí)期。解剖取得的目標(biāo)組織保存于RNA保存液中，-30 ℃待用。目標(biāo)組織包括所有樣品的性腺組織，以及5—8月樣品的外套膜、唇瓣、消化腺、閉殼肌和鰓組織。2016年8月采集長牡蠣胚胎各發(fā)育時(shí)期樣品，置于RNA保存液中-30 ℃保存待用。

1.2長牡蠣Fem-1b和Fem-1c基因克隆

采用Trizol法對(duì)長牡蠣各組織總RNA進(jìn)行提取。提取結(jié)束后利用Nanodrop檢測(cè)所提的RNA的濃度，接著利用1.5%瓊脂糖凝膠電檢測(cè)所提RNA完整性。利用試劑盒SMARTTMRACE cDNA完成RACE cDNA第一鏈的合成。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、池蝶蚌(Hyriopsisschlegelii)和加州海兔(Aplisiacalifornica)等物種的Fem-1b和Fem-1c蛋白序列，利用這些序列與長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)獲得預(yù)測(cè)長牡蠣Fem-1b和Fem-1c基因片段。根據(jù)所得片段設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增核心序列并驗(yàn)證。根據(jù)驗(yàn)證所得的核心序列設(shè)計(jì)RACE引物，采用巢式PCR的方法擴(kuò)增得到2個(gè)基因的3′和5′端序列。實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。利用1.5%瓊脂糖凝膠電檢測(cè)得到PCR產(chǎn)物長度符合預(yù)期后采用DNA凝膠回收純化試劑盒的操作對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收。將目的片段連接至pEASY-T1載體，后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。通過藍(lán)白斑篩選的方式挑取陽性克隆，經(jīng)過菌液PCR檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果挑選合適的菌液送至北京華大基因測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)目的基因片段進(jìn)行拼接得到目的基因cDNA全長序列。

表1 Fem-1b和Fem-1c引物信息Table 1 The information of the Fem-1b and Fem-1c genes primers in Crassostrea gigas

1.3 長牡蠣Fem-1b和Fem-1c基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ORF finder軟件對(duì)目的基因開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測(cè)。氨基酸序列的同源性比對(duì)由NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序完成。通過NJ法建立的進(jìn)化樹通過MEGA5.0軟件完成。除此之外，等電點(diǎn)以及相對(duì)分子質(zhì)量的預(yù)測(cè)則是通過在線軟件工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 RT-PCR分析

根據(jù)周年樣品性腺石蠟切片的結(jié)果將長牡蠣性腺樣品分為增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期(休止期無法分辨雌雄)5個(gè)時(shí)期。選擇每月占多數(shù)時(shí)期的樣品雌雄各3個(gè)組成周年樣品。他們對(duì)應(yīng)的生長發(fā)育時(shí)期依次是10月至次年2月為休止期，3月為增殖期，4、5月為生長期，6、7月為成熟期，8、9月為排放期。組織分布的分析選擇6、7月中處于成熟期個(gè)體的雌雄性腺、外套膜、閉殼肌、唇瓣、消化腺和鰓。不同胚胎時(shí)期的樣品包括受精卵、2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、囊胚期、殼頂幼蟲，D形幼蟲和眼點(diǎn)幼蟲。通過Trizol法對(duì)所有目的組織樣品進(jìn)行總RNA的提取，然后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)克隆所得的目的基因片段設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物。成熟期各組織表達(dá)分析方面，利用EF2基因的表達(dá)量作為內(nèi)參而對(duì)于胚胎幼蟲表達(dá)分析采用18S基因的表達(dá)量作為內(nèi)參[16]。實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。實(shí)驗(yàn)使用Roche480熒光定量PCR儀對(duì)目標(biāo)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行分析，每一組設(shè)置3個(gè)樣品。PCR實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件如下：94 ℃條件下5 s，60 ℃ 30 s總共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法 對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)以 3 樣本平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)來表示, 使用 SPSS 16.0 進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 使用 Turkey B 檢驗(yàn)法對(duì)其進(jìn)行兩兩差異比較, 以P<0.05 作為顯著性差異水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 長牡蠣Fem-1b和Fem-1c基因序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接得到長牡蠣Fem-1b和Fem-1ccDNA全長序列(見圖1)。Cg-Fem-1bcDNA序列全長為2 580 bp，開放閱讀框1 911 bp，共編碼了636個(gè)氨基酸。通過在線軟件Expasy compute Pi/Mw推測(cè)Cg-Fem1b的分子量為71.32 kDa，等電點(diǎn)為5.46。Cg-Fem-1c基因全長為2 147 bp，其中開放閱讀框1 869 bp，編碼622個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.93，相對(duì)分子質(zhì)量為17.71 kDa。

(小寫字母表示非編碼區(qū)序列，大寫字母表示編碼區(qū)序列。The lowercase indicates the untranslated region ofCg-Fem1bandCg-Fem-1c, while the uppercase indicates the open reading frame.)

圖1Fem-1b和Fem-1c基因核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列信息

Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence ofFem-1bandFem1cgene fromCrassostreagigas

Fem-1b和Fem-1c編碼蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示，Cg-Fem-1b的氨基酸序列具有6個(gè)典型的錨定蛋白重復(fù)序列(Anyrin repeat)模體結(jié)構(gòu)而Cg-Fem-1c序列含有7個(gè)ANK模體結(jié)構(gòu)(見圖2)。

Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c兩序列比對(duì)結(jié)果顯示，兩序列之間同源性較低，只有37%。然而在與其他物種的氨基酸的序列比對(duì)中卻發(fā)現(xiàn)它們與相應(yīng)基因的具有較高的同源性。Cg-Fem-1b與池蝶蚌的相似度可以達(dá)到59%。此外，相似度較高的物種大多是雙殼貝類，比如Cg-Fem-1b與加州海兔和光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata)的相似度分別為50%和51%。Cg-Fem-1c與池蝶蚌的相似度高達(dá)79%。除此之外，與章魚(Octopusbimaculoides)和光滑雙臍螺也具有較高的相似度，分別是72%和64%。通過NCBI的數(shù)據(jù)庫下載獲得大量模式動(dòng)物及近緣種的Fem-1基因的氨基酸序列(見表2)，使用軟件MEGA5.0通過NJ法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3)。經(jīng)過對(duì)長牡蠣基因組的篩選，我們得到包括本文2個(gè)目的基因在內(nèi)的一共8個(gè)被標(biāo)注為長牡蠣Fem-1基因的序列。通過8個(gè)序列與模式動(dòng)物中Fem-1a、Fem-1b、Fem-1c以及近緣基因Fem-3基因的進(jìn)化樹構(gòu)建，我們發(fā)現(xiàn)Cg-Fem-1b與其他模式動(dòng)物的Fem-1b基因聚為一支而Cg-Fem-1c與其他雙殼貝類的Fem-1c聚為一支。除此之外，其他被標(biāo)注為長牡蠣Fem-1基因的序列則沒有與模式動(dòng)物的Fem-1基因聚類。具體的聚類分支結(jié)果與相似性比對(duì)結(jié)果基本一致，Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c都優(yōu)先與池蝶蚌的相應(yīng)基因聚為一支，與脊椎動(dòng)物進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 長牡蠣Fem-1b和Fem-1c基因在不同組織、周年樣品性腺以及不同胚胎幼蟲發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分別分析了Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在處于成熟期的長牡蠣個(gè)體的各組織(閉殼肌，鰓，消化腺，外套膜，唇瓣以及雌性性腺)的表達(dá)模式。整體上看，在各組織的內(nèi)參基因CT值均小于25且各組織目的基因的CT值較小，因此我們可以發(fā)現(xiàn)Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c的表達(dá)具有廣泛表達(dá)的特點(diǎn)，且精巢的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)。除此之外，Cg-Fem-1b在唇瓣，閉殼肌中也有相對(duì)于除精巢外其他組織顯著高的表達(dá)量(P<0.05)，而Cg-Fem-1c在除精巢外的其他組織之間不存在顯著性差異(P>0.05)(見圖4)。

(A.Cg-Fem-1b碼蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；B.Cg-Fem-1c編碼蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。A. Prediction of protein structure ofCg-Fem-1b. B. Prediction of protein structure ofCg-Fem-1c.)

圖2Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c編碼蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

Fig.2 Prediction of protein structure ofCg-Fem-1bandCg-Fem-1c

(GenBank注冊(cè)號(hào)見表2 Genbank Accession numbers are indicated in Table 2)圖3 長牡蠣與其他代表物種Fem-1b和Fem-1c氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 A phylogenetic tree based on the Fem-1b and Fem-1c family members of Crassostrea gigas and other representative species

名稱Species登錄號(hào)Genbank名稱Species登錄號(hào)Genbank人HomosapiensFem?1cNP＿064562．1人HomosapiensFem?1aNP＿061178．1鼠MusmusculusFem?1cNP＿775599．1鼠MusmusculusFem?1aNP＿034322．3雞GallusgallusFem?1cXP＿428816．3雞GallusgallusFem?1aXP＿418271．3蛙XenopuslaevisFem?1CNP＿001090163．1斑馬魚DaniorerioFem?1aNP＿956131．1斑馬魚DaniorerioFem?1cAAO64431．1青鱂OryziaslatipesFem?1aXP＿004079226．1池蝶蚌HyriopsisschlegeliiFem?1cAIG62900．1長牡蠣CrassostreagigasFem?1likeXP＿011441062．1海兔AplysiacalifornicaFem?1cXP＿005097434．1長牡蠣CrassostreagigasFem?1likeXP＿011439298．1毛蟹EriocheirsinensisFem?1cAKS25866．1長牡蠣CrassostreagigasFem?1likeXP＿019924245人HomosapiensFem?1bNP＿056137．1長牡蠣CrassostreagigasFem?1likeXP＿011429054．1鼠RattusnorvegicusFem?1bNP＿001101627．1長牡蠣CrassostreagigasFem?1likeXP＿011418266．1雞GallusgallusFem?1bNP＿001025724．1長牡蠣CrassostreagigasFem?1likeXP＿019924203．1青鱂OryziaslatipesFem?1bXP＿004086250．1秀麗隱桿線蟲Caenorhabditisele?gansFem?3NP＿001255365．1斑馬魚DaniorerioFem?1bXP＿695502．4腐生水果線蟲CaenorhabditisremaneiFem?3AAX16084．1蛙XenopuslaevisFem?1bNP＿001085685．1廣桿線蟲CaenorhabditisbriggsaeFem?3AAN37405．1毛蟹EriocheirsinensisFem?1bAKS25865．1

Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c表達(dá)具有明顯的性別二態(tài)性，即精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢(見圖4)。除此之外，休止期(2015年10月—2016年2月)的表達(dá)量顯著低于其他性腺發(fā)育時(shí)期(P<0.05)。精巢中Cg-Fem-1c在3月(增殖期)和4月(生長期)表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)。相比之下，Cg-Fem-1b在6月(成熟期)才出現(xiàn)顯著地上調(diào)，并在之后的7月(成熟期)保持在了顯著高于其他組的水平(P<0.05)。相比之下，卵巢中兩基因的表達(dá)量，除了7月表達(dá)量顯著高于其他組外，其他月份卵巢中的表達(dá)量之間沒有明顯變化(P>0.05)(見圖5)。

(A.Cg-Fem-1b在不同組織中的表達(dá)情況; B.Cg-Fem-1c在不同組織中的表達(dá)情況。不同的字母代表差異性顯著(P<0.05，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)。A. Relative expression ofCg-Fem-1b. B. Relative expression ofCg-Fem-1c. Different letters indicate significant differences statistically(P<0.05，Means±SE,n=3).)

圖4Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在不同組織中的表達(dá)情況
Fig.4 Relative expression ofCg-Fem-1bandCg-Fem-1cin different tissues

(A.Cg-Fem-1b在周年性腺樣品中的表達(dá)情況。 B.Cg-Fem-1c在周年性腺樣品中的表達(dá)情況。 不同的字母代表差異性顯著(P<0.05，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)。A. Relative expression ofCg-Fem-1buring different months.B. Relative expression ofCg-Fem-1cduring different months. Different letters indicate significant differences statistically(P<0.05，Means±SE,n=3).)

圖5Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在周年性腺樣品中的表達(dá)情況
Fig.5 Relative expression ofCg-Fem-1bandCg-Fem-1cduring different months

針對(duì)不同胚胎幼蟲發(fā)育階段的熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c的整體表達(dá)模式類似，最高表達(dá)量都出現(xiàn)在囊胚期并且顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)。Cg-Fem-1b在囊胚期的表達(dá)量是受精卵表達(dá)量的5.56倍，而Cg-Fem-1c在囊胚期的表達(dá)量是受精卵時(shí)期表達(dá)量的18.38倍(見圖6)。除此之外，Cg-Fem-1b在2細(xì)胞期、4細(xì)胞期以及幼蟲期顯著高于除囊胚期外的其他時(shí)期(P<0.05)。Cg-Fem-1c和Cg-Fem-1c在胚胎發(fā)育早期，即2細(xì)胞期和4細(xì)胞期以及幼蟲期也有顯著高于除囊胚期外其他時(shí)期的高表達(dá)模式(P<0.05)。Cg-Fem-1c和Cg-Fem-1c在受精卵、擔(dān)輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲以及眼點(diǎn)幼蟲表達(dá)量顯著低于其他時(shí)期(P<0.05)且彼此之間不存在顯著性差異(P>0.05)。

(A.Cg-Fem-1b在不同胚胎及幼蟲發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況; B.Cg-Fem-1c在不同胚胎及幼蟲發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況。不同的字母代表差異性顯著(P<0.05，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)。 A. Relative expression ofCg-Fem-1bduring different embryonic and larval developmental stages;B. Relative expression ofCg-Fem-1cduring different embryonic and larval developmental stages. Different letters indicate significant differences statistically(P<0.05，Means±SE,n=3).)

圖6Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在不同胚胎及幼蟲發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況
Fig.6 Relative expression ofCg-Fem-1bandCg-Fem-1cduring different embryonic and larval developmental stages

3 討論

總體來看,Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在組織分布情況中具有類似的表達(dá)模式。Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在所有檢測(cè)組織(閉殼肌，鰓，消化腺，外套膜，唇瓣以及雌性性腺)均有表達(dá)。在這種廣泛表達(dá)的特征在許多動(dòng)物的研究中都有所體現(xiàn)，比如池蝶蚌、線蟲、東亞飛蝗和毛蟹等物種[17-20]。這種不同存在于不同物種之間相似的表達(dá)特征說明了Fem-1基因在基因表達(dá)上具有一定的保守性。由此我們推測(cè)長牡蠣中Fem-1b和Fem-1c兩個(gè)基因可能參與了基礎(chǔ)并且廣泛的生物學(xué)過程，比如在秀麗隱桿線蟲中Fem-1基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[12]。盡管Fem-1基因在不同物種中都有廣泛表達(dá)的模式，但是其具體的表達(dá)模式卻各有特點(diǎn)。在人類和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)em-1a在成體骨骼肌和心臟中具有高表達(dá)的特征，而Fem-1b和Fem-1c則在睪丸中表達(dá)豐富，研究者推測(cè)Fem-1b參與了雄性性別決定的過程，而Fem-1c在精子發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用[9-10]。在本實(shí)驗(yàn)中Cg-Fem-1b除了在精巢中高表達(dá)之外，在閉殼肌以及唇瓣中也有顯著高于其他組織的表達(dá)特點(diǎn)。東亞飛蝗的研究表明，F(xiàn)em-1基因在精巢中的表達(dá)量顯著高于其他組織[21-23]。在毛蟹的研究中發(fā)現(xiàn)Fem-1a、Fem-1b和Fem-1c三個(gè)基因的最高表達(dá)量分別出現(xiàn)在肝胰腺、精巢和肌肉中[20]。這種表達(dá)模式被認(rèn)為與毛蟹的性別決定和分化過程具有重要的關(guān)聯(lián)，因?yàn)橛醒芯勘砻髟诿分懈我认倏梢詾樾韵俚陌l(fā)育提供大量的能量[23-24]。由此我們推測(cè)，Cg-Fem-1b在閉殼肌中的高表達(dá)可能暗示了在肌肉為精巢的發(fā)育提供了能量。此外，Cg-Fem-1c除了在精巢中表達(dá)量顯著高于其他組織外，其他組織的表達(dá)量之間不存在顯著性差異。池蝶蚌Fem-1c在精巢中表達(dá)量最高，此外在肝胰腺、腸和卵巢中也有較高表達(dá)量而在腎臟中則幾乎不表達(dá)[17]。在已有的長牡蠣組織表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)，長牡蠣的Fem-1b和Fem-1c都在血淋巴中具有較高的表達(dá)水平，除了血淋巴之外，F(xiàn)em-1b在唇瓣和卵巢中具有較高表達(dá)量而Fem-1c在閉殼肌中具有較高的表達(dá)[13]。這與我們的研究結(jié)果有一定差別，我們推測(cè)這種差別可能是樣品所處的不同海域的海區(qū)環(huán)境條件不同造成的。綜上，在長牡蠣中Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c兩個(gè)基因都具有精巢中的高表達(dá)模式，我們推測(cè)它們很可能都參與了長牡蠣精巢的發(fā)育和精子的形成。此外，Cg-Fem-1b在閉殼肌以及唇瓣中也具有相對(duì)較高的表達(dá)模式，我們推測(cè)Cg-Fem-1b在閉殼肌中的高表達(dá)可能與精巢發(fā)育過程中的能量供應(yīng)有關(guān)。

在秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)Fem-1在性別決定和分化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[1-2]。在很多物種的研究中都發(fā)現(xiàn)了Fem-1基因，并且呈現(xiàn)出與性別相關(guān)的特征。研究者在大馬哈魚虱(Caligusrogercresseyi)的研究中通過對(duì)雌雄個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選得到了Fem-1b，發(fā)現(xiàn)其具有性別表達(dá)差異的模式[25]。同樣是通過雌性性腺的轉(zhuǎn)錄組分析，斑馬魚中發(fā)現(xiàn)Fem-1c基因在卵巢中具有高表達(dá)的特征，然而其具體的功能還不明確[26]。在斑胸草雀(Zebrafinch)發(fā)現(xiàn)Fem-1c基因存在2個(gè)拷貝，分別位于Z和W兩條性染色體中[27]。斑節(jié)對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)Fem-1基因上存在一個(gè)與性別決定有著明顯關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)[28]。在長牡蠣中，F(xiàn)em-1b和Fem-1c在精巢中表達(dá)量顯著高于其他組織，而且在各個(gè)繁殖期精巢的表達(dá)量都顯著高于休止期。2個(gè)基因不同的是，Cg-Fem-1b在6～9月(成熟期和排放期)的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期，這暗示了Cg-Fem-1b基因可能在精巢功能的維持以及誘發(fā)精子排放等發(fā)面發(fā)揮了重要的作用。反觀Cg-Fem-1c基因則是在3和4月的(增殖期和生長期)表達(dá)量顯著高于其他組，這種在精巢發(fā)育初期高表達(dá)的模式說了Cg-Fem-1c可能參與了精巢早期的發(fā)育以及精子的形成。在東亞飛蝗的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著精巢的發(fā)育Fem-1三個(gè)基因表達(dá)量都有顯著的上調(diào)，相比Fem-1c在第3天有顯著性上調(diào)，F(xiàn)em-1a和Fem-1b基因的上調(diào)發(fā)生在第12天[18]。我們推測(cè)長牡蠣的Fem-1基因的表達(dá)可能與東亞飛蝗類似，即Fem-1c表達(dá)量的顯著性提高的時(shí)期與Fem-1b有所不同，這暗示了2個(gè)目的基因在精巢發(fā)育中可能起到了不同的作用。然而具體作用如何，還需要進(jìn)一步的分析。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)通過外源干擾的手段降低了Fem-1c基因的表達(dá)，并沒有導(dǎo)致雌性幼崽數(shù)量的顯著提高，研究者得出結(jié)論Fem-1c可能與小鼠的性別分化和性別決定沒有關(guān)系[29]。這暗示了Fem-1c基因在性別分化作用中不保守的特點(diǎn)，因此其基因的具體功能還需要進(jìn)一步的探究。針對(duì)不同胚胎幼蟲發(fā)育階段的熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cg-Fem-1c在胚胎發(fā)育期的表達(dá)模式與Cg-Fem-1b類似，即都在2細(xì)胞和4細(xì)胞期顯著上調(diào)，在之后的囊胚期繼續(xù)上調(diào)至最高值，后隨著胚胎幼蟲的發(fā)育表達(dá)量逐漸降低。兩者不同的是Cg-Fem-1c在囊胚期表達(dá)量是其在受精卵時(shí)期表達(dá)量的18.83倍，而Cg-Fem-1b只有5.56倍。隨著幼蟲發(fā)育，Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c表達(dá)量持續(xù)降低并在殼頂幼蟲和眼點(diǎn)幼蟲時(shí)達(dá)到最低水平。在毛蟹的研究中也有類似的表達(dá)模式，F(xiàn)em-1基因從受精卵開始表達(dá)，持續(xù)上調(diào)至囊胚期后劇烈下降并保持在低水平[20]。囊胚期是細(xì)胞分化的關(guān)鍵時(shí)期，Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在胚胎發(fā)育早期，特別是囊胚的高表達(dá)模式暗示了其在組織器官早期發(fā)育中的作用以及可能參與了性別決定和分化的過程。

4 結(jié)論

對(duì)不同胚胎發(fā)育時(shí)期的樣品分析顯示，Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c具有類似的表達(dá)模式，即都是在胚胎發(fā)育早期表達(dá)量上升并在囊胚期達(dá)到最大值。囊胚期是組織器官形成以及細(xì)胞分化的重要時(shí)期，我們推測(cè)Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c可能參與了性別決定和性別分化的過程。研究還發(fā)現(xiàn)，Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c兩基因雖然同源性較低，但是它們的表達(dá)模式相像。究竟Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c在性腺發(fā)育中起到怎樣的作用以及Cg-Fem-1b和Cg-Fem-1c之間的相互作用關(guān)系如何還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Doniach T, Hodgkin J. A sex-determining gene,fem-1, required for both male and hermaphrodite development inCaenorhabditiselegans[J]. Developmental Biology, 1984, 106(1): 223-235.

[2] Hodgkin J. Sex determination and dosage compensation inCaenorhabditiselegans[J]. Annual Review of Genetics, 1987, 21(1): 133-154.

[3] Kimble J, Edgar L, Hirsh D. Specification of male development inCaenorhabditiselegans: The fem genes[J]. Developmental Biology, 1984, 105(1): 234-239.

[4] Spence A M, Coulson A, Hodgkin J. The product offem-1, a nematode sex-determining gene, contains a motif found in cell cycle control proteins and receptors for cell-cell interactions[J]. Cell, 1990, 60(6): 981-990.

[5] Zarkower D, Hodgkin J. Molecular analysis of theC.eleganssex-determining genetra-1: A gene encoding two zinc finger proteins[J]. Cell, 1992, 70(2): 237-249.

[6] Kuwabara P E. A complex solution to a sexual dilemma[J]. Developmental Cell, 2007, 13(1): 6-8.

[7] Barnes T M, Hodgkin J. Thetra-3 sex determination gene ofCaenorhabditiselegansencodes a member of the calpain regulatory protease family[J]. The EMBO Journal, 1996, 15(17): 4477.

[8] Krakow D, Sebald E, King L M, et al. Identification of humanFEM1A, the ortholog of aC.eleganssex-differentiation gene[J]. Gene, 2001, 279(2): 213-219.

[9] Ventura-Holman T, Maher J F. Sequence, organization, and expression of the humanFEM1Bgene[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267(1): 317-320.

[10] Ventura-Holman T, Seldin M F, Li W, et al. The MurineFem1Gene Family: Homologs of theCaenorhabditiselegansSex-Determination ProteinFEM-1[J]. Genomics, 1998, 54(2): 221-230

[11] Ventura-Holman T, Lu D, Si X, et al. The Fem1c genes: conserved members of theFem1 gene family in vertebrates[J]. Gene, 2003, 314: 133-139.

[12] Chan S L, Yee K S Y, Tan K M L, et al. TheCaenorhabditiseleganssex determination proteinFEM-1 is aCED-3 substrate that associates withCED-4 and mediates apoptosis in mammalian cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(24): 17925-17928.

[13] Zhang N, Xu F, Guo X. Genomic analysis of the Pacific oyster (Crassostrea gigas) reveals possible conservation of vertebrate sex determination in a mollusc[J]. G3 (Bethesda, Md.), 2014, 4(11): 2207.

[14] Guo X M, Hedgecock D, Hershberger W K, et al. Genetic determinants of protandric sex in the Pacific oyster, Crassostrea gigas Thunberg.[J]. Evolution, 1998, 52(2): 394-402.

[15] Hedrick P W, Hedgecock D. Sex determination: genetic models for oysters.[J]. Journal of Heredity, 2010, 101(5): 602-611.

[16] Du Y, Zhang L, Xu F, et al. Validation of housekeeping genes as internal controls for studying gene expression during Pacific oyster (Crassostreagigas) development by quantitative real-time PCR[J]. Fish& Shellfish Immunology, 2013, 34(3): 939-945.

[17] 熊文芳. 池蝶蚌性別決定相關(guān)基因feminization-1基因的分子特征及表達(dá)分析[D]. 南昌： 南昌大學(xué), 2014.

Xiong W F. Molecular characteristics and expression analysis of feminization-1 gene relatedto sex-detemination from fresh water pearl mussel,Hyriopsisschlegelii[D]. Nanchang: Nanchang University, 2014.

[18] 時(shí)紅, 郝友進(jìn), 陳斌, 等. 東亞飛蝗fem-1 基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2013, 56(7): 729-737.

Shi H, Hao Y J, Chen B, et al. Cloning and expression analysis offem-1 genes from the oriental migratory locust,Locustamigratoriamanilensis(Orthoptera: Locustidae).[J]. Acta Entomologica Sinica, 2013, 56(7): 729-737.

[19] 侍建濤, 李志, 桂建芳,等. 斑馬魚fem-1ccDNA克隆與表達(dá)分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2015, 39(3): 459-467.

Shi J T, Li Z, Gui J F, et al. The cloning and expression analysis of zebrafishfem-1c, a member offem-1 family.[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(3): 459-467.

[20] Song C, Cui Z, Hui M, et al. Molecular characterization and expression profile of threeFem-1 genes inEriocheirsinensisprovide a new insight into crab sex-determining mechanism[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 189: 6-14.

[21] Kang L, Chen X Y, Zhou Y, et al. The analysis of large-scale gene expression correlated to the phase changes of theMigratorylocust[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(51): 17611-17615.

[22] Ma Z, Yu J, Kang L. LocustDB: A relational database for the transcriptome and biology of the migratory locust (Locustamigratoria)[J]. BMC Genomics, 2006, 7(1): 11.

[23] Jiang H, Yin Y, Zhang X, et al. Chasing relationships between nutrition and reproduction: A comparative transcriptome analysis of hepatopancreas and testis fromEriocheirsinensis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2009, 4(3): 227-234.

[24] Wang W, Wu X, Liu Z, et al. Insights into hepatopancreatic functions for nutrition metabolism and ovarian development in the crabPortunustrituberculatus: Gene discovery in the comparative transcriptome of different hepatopancreas stages[J]. PloS One, 2014, 9(1): 84921.

[25] Farlora R, Araya-Garay J, Gallardo-Escárate C. Discovery of sex-related genes through high-throughput transcriptome sequencing from the salmon louseCaligusrogercresseyi[J]. Marine Genomics, 2014, 15: 85-93.

[26] Sreenivasan R, Cai M, Bartfai R, et al. Transcriptomic analyses reveal novel genes with sexually dimorphic expression in the zebrafish gonad and brain[J]. PloS One, 2008, 3(3): 1791.

[27] Itoh Y, Kampf K, Arnold A P. Disruption of FEM1C-W gene in zebra finch: Evolutionary insights on avian ZW genes[J]. Chromosoma, 2009, 118(3): 323-334.

[28] Robinson N A, Gopikrishna G, Baranski M, et al. QTL for white spot syndrome virus resistance and the sex-determining locus in the Indian black tiger shrimp (Penaeusmonodon)[J]. BMC Genomics, 2014, 15(1): 731.

[29] Schlamp C L, Thliveris A T, Li Y, et al. Insertion of the βGeo promoter trap into theFem1cgene of ROSA3 mice[J]. Molecular and Cellular Biology, 2004, 24(9): 3794-3803.