李在建， 王　旭， 龍良啟， 操繼躍

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬呼吸道常在的一種NAD依賴的革蘭氏陰性菌，屬于巴氏桿菌科[1]，顯微鏡下觀察為多種形態(tài)的桿狀細(xì)菌。在某些特殊環(huán)境下能入侵機(jī)體，從而引發(fā)豬的漿液性或纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等，俗稱格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)[2-3]或引起豬的急性敗血癥[4]。副豬嗜血桿菌病主要影響2周～4月齡的豬，常在仔豬保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)50%。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模的迅速擴(kuò)大和養(yǎng)殖模式的改變，近些年流行趨勢(shì)日趨嚴(yán)重，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性病原，造成了大量的經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。唾液酸作為細(xì)菌代謝中一種重要的分子，一方面可以作為細(xì)菌的能量供細(xì)菌生存所需，另一方面細(xì)菌又可以利用唾液酸作為自己的結(jié)構(gòu)物質(zhì)與宿主細(xì)胞相互作用。

本研究以副豬嗜血桿菌的nanH基因?yàn)檠芯繉?duì)象，研究副豬嗜血桿菌不同標(biāo)準(zhǔn)菌株中nanH序列的差異及神經(jīng)氨酸酶活性的不同；同時(shí)第一次通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)獲得有活性的神經(jīng)氨酸酶。

1　材料與方法

1.1　載體與質(zhì)粒

原核表達(dá)載體載體pET-28a(+)和pET-32a(+)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2　工具酶及主要試劑

所有的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、高保真酶Pyrobest DNA Polymerase 均購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)。

PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒均為Omiga產(chǎn)品。

BL21(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

胰酶大豆瓊脂(TSA)、胰酶大豆瓊脂(TSB)均購(gòu)自Difco公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購(gòu)自中國(guó)上?；瘜W(xué)試劑公司。

瓊脂糖、胰蛋白胨以及酵母浸出物等購(gòu)自O(shè)XOID公司。

神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物制品公司。

1.3　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

nanH全長(zhǎng)PCR純化回收產(chǎn)物酶切體系(總體積50.0 μL)見(jiàn)表1。載體pET-28a(+)酶切體系(總體積 50.0 μL)見(jiàn)表2。

表1　nanH全長(zhǎng)PCR純化回收產(chǎn)物酶切體系

表2　載體pET-28a(+)酶切體系

載體pET-32a(+)酶切體系(總體積50.0 μL)見(jiàn)表3。

表3　載體pET-32a(+)酶切體系

純化回收的PCR酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)體系(總體積20.0 μL)見(jiàn)表4。

表4　純化回收的PCR酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)體系

所有組分加完后，使用移液器充分混勻，置于22 ℃溫箱中連接過(guò)夜。取10.0 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，小量制備質(zhì)粒，鑒定正確的質(zhì)粒-20℃保存。

1.4　神經(jīng)氨酸酶粘附功能的研究

(1)使用接種環(huán)將副豬嗜血桿菌0165均勻接種于TSA V.S. 平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h，使用無(wú)菌5 mL PBS將細(xì)菌洗下來(lái)，5 000 r/min離心5 min，收集菌體。盡量棄凈上清，使用1 mL DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液重懸，并取相應(yīng)量按1 ∶100比例用生長(zhǎng)液稀釋。(2)從CO2培養(yǎng)箱中取出提前1 d接好的24孔板的細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)。棄掉每孔的生長(zhǎng)液，使用PBS洗滌細(xì)胞2次。(3)將細(xì)菌懸液加入到細(xì)胞板中(MOI=100)，陰性對(duì)照每孔加入20 μL空載體破碎后上清，樣品組加入神經(jīng)氨酸酶樣品，室溫4 000 r/min離心10 min，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h。(4)取出細(xì)胞板，使用PBS洗2次，每孔加入100 μL胰酶將細(xì)胞消化，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，然后加入900 μL PBS補(bǔ)足至1 mL，反復(fù)吹打至細(xì)胞完全裂解。(5)細(xì)胞裂解產(chǎn)物取10-1、10-22個(gè)稀釋度涂平板計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同細(xì)菌間nanH基因序列比較結(jié)果

將nanH基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌屬中，本試驗(yàn)測(cè)定的副豬嗜血桿菌 SH0165菌株nanH基因序列與多殺性巴氏桿菌(PasteurellamμLtocida)同源性達(dá)到60%，與溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)同源性達(dá)到58%，與其他非巴氏桿菌屬如產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)同源性達(dá)到38%，與索氏梭菌(Clostridiumsordellii)同源性達(dá)到34%，與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimuriu)同源性達(dá)到31%。

將15株副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株的神經(jīng)氨酸酶(NA)做進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2　副豬嗜血桿菌不同標(biāo)準(zhǔn)血清型神經(jīng)氨酸酶活性分析

提取副豬嗜血桿菌13株標(biāo)準(zhǔn)株總蛋白后，使所有待測(cè)樣品蛋白濃度統(tǒng)一為2.32 μg/μL，在S=60情況下使用BioTeK Synergy HT熒光酶標(biāo)儀和碧云天神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其中神經(jīng)氨酸酶活性，每個(gè)樣品平行3次，熒光檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)不同血清型副豬嗜血桿菌菌株的神經(jīng)氨酸酶活性并不相同。

2.3　神經(jīng)氨酸酶可溶性表達(dá)的研究

2.3.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定nanH基因全長(zhǎng)表達(dá)從起始密碼子開(kāi)始，至終止密碼子結(jié)束。因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)引物時(shí)引入了酶切位點(diǎn)，因此將PCR產(chǎn)物與載體分別酶切后，將nanH基因分別插入表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定，所得條帶與預(yù)期一致(圖3)。

2.3.4SDS-PAGE鑒定將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-NA轉(zhuǎn)入BL21(DE3) pLysS原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆后，18 ℃低溫誘導(dǎo)16 h，集菌破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。由圖4表明，重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-NA轉(zhuǎn)化菌株在大小約為80 ku處有1條特異性表達(dá)帶，而在pET-32a空載體菌株的相應(yīng)位置沒(méi)有此蛋白帶，證明NA在大腸桿菌BL21(DE3) pLysS中表達(dá)在上清，即為可溶性表達(dá)。同時(shí)，使用神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清樣品，S=70時(shí)，3次平行結(jié)果為289、271、296，平均值為285，以pET-32a轉(zhuǎn)化BL21(DE3) pLysS破碎后上清為陰性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果為79、89、71，平均值為79。實(shí)際熒光值=陽(yáng)性值-陰性值，因此實(shí)際熒光值為206，結(jié)果證明上清中NA有活性。

4　討論

通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌nanH基因高度保守，且在15株標(biāo)準(zhǔn)血清型中其核苷酸同源性高達(dá)99.54%，而氨基酸的同源性高達(dá)99.29%，證明神經(jīng)氨酸酶(NA)是副豬嗜血桿菌生存所必需的[6]。通過(guò)試驗(yàn)推測(cè)，可能神經(jīng)氨酸酶并不直接決定副豬嗜血桿菌毒力的高與低，但卻是副豬嗜血桿菌具有毒力所必不可少的條件。

同時(shí)，本試驗(yàn)研究了副豬嗜血桿菌15株標(biāo)準(zhǔn)菌株以及其他一些細(xì)菌的神經(jīng)氨酸酶的核苷酸和氨基酸序列，尋找出副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶的活性區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這些活性區(qū)域高度保守[8]。缺失NA或調(diào)節(jié)NA的基因制成弱毒疫苗，或者添加某種抑制劑抑制神經(jīng)氨酸酶的活性從而降低細(xì)菌的毒力，也可以成為未來(lái)神經(jīng)氨酸酶應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的一個(gè)方面。

本試驗(yàn)嘗試使用大腸桿菌原核表達(dá)神經(jīng)氨酸酶，在試驗(yàn)過(guò)程中使用了多種表達(dá)載體，如pET-28a、pET-30a、pET-32a、pGEX-KG，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后神經(jīng)氨酸酶都以包涵體的形式存在，但在經(jīng)過(guò)包涵體的純化和復(fù)性后檢測(cè)重組蛋白沒(méi)有活性，嘗試了多種包涵體復(fù)性的方法，卻一直無(wú)法獲得有活性的蛋白。最后經(jīng)過(guò)數(shù)次嘗試，終于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plysS表達(dá)菌株，經(jīng)過(guò)18 ℃低溫誘導(dǎo)16 h后重組蛋白破碎后在上清中，也就是以可溶性表達(dá)的形式存在，使用神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白有活性[9-10]。但是蛋白表達(dá)量較低，使用蛋白純化儀多次純化無(wú)法獲得目的蛋白。

神經(jīng)氨酸酶是唾液酸為副豬嗜血桿菌所利用的第一步，而對(duì)于副豬嗜血桿菌更為重要的是唾液酸的代謝。如研究者所說(shuō)，唾液酸不僅是世界上最有趣的一個(gè)分子，更為最重要的一個(gè)分子。如前言所述，唾液酸進(jìn)入細(xì)菌后不僅可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)菌提供碳源和氮源，另一方面唾液酸參與構(gòu)成細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌與宿主的互作中起到重要的作用，如逃避宿主先天免疫系統(tǒng)的殺傷、促進(jìn)生物被膜的形成以及提高毒素的毒力[11-12]。因此，研究唾液酸代謝過(guò)程的重要性不言而喻。

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