周美娟，張瑩，叢方地,,通信作者，張樹(shù)林，劉黎瑤，羅巍

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乙酸肉桂酯在固定化脂肪酶反應(yīng)器中的合成

周美娟1，張瑩1，叢方地1,2,通信作者，張樹(shù)林2，劉黎瑤1，羅巍1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

為提高乙酸肉桂酯的酶促合成效果，在柱形玻璃瓶中，將脂肪酶（lipase）固定在脫脂棉上，形成一種簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器，用于催化肉桂醇與乙酸乙烯酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。結(jié)果表明：在37℃、160 r/min條件下，12 h后，反應(yīng)器中的固定化酶可使92％的底物轉(zhuǎn)化，而酶粉僅能轉(zhuǎn)化35％的底物。在靜置條件下，分別在37、25和4 ℃保溫12 h，底物轉(zhuǎn)化率分別為88%、84%和44％。在每次6 h的重復(fù)催化試驗(yàn)中，固定化酶和酶粉轉(zhuǎn)化底物能力每小時(shí)降低率分別為0.3%、0.5%。可見(jiàn)，反應(yīng)器中的固定化酶相對(duì)于酶粉，其催化活性和非水穩(wěn)定性明顯提高，即使在室溫和靜置條件下，這種固定化酶反應(yīng)器也表現(xiàn)出較高的催化活性，是一種低碳、高效的固定化酶反應(yīng)器。

乙酸肉桂酯；脂肪酶；脫脂棉；酶活性；酶穩(wěn)定性

食用香精是食品工業(yè)不可或缺的成分，大多食用香精的分子是酯類(lèi)化合物，廣泛存在于自然界中，具有濃郁的花香、果香[1]。乙酸肉桂酯是我國(guó)規(guī)定可以使用的一種食用香精，具有甜香、花香，并伴有濃郁的又辣又甜的菠蘿味道[2]。其制備方法有多種，起初只能從天然植物中提取，但提取量極少且純度較低，不能滿足市場(chǎng)需要[3]。而后，采用化學(xué)法合成純度相對(duì)較高的乙酸肉桂酯，但常伴有副反應(yīng)發(fā)生，且后續(xù)分離提純工藝繁瑣，對(duì)設(shè)備要求高，易造成環(huán)境污染[4]。目前，工業(yè)上更多地使用微生物脂肪酶來(lái)催化合成重要的酯類(lèi)化合物，特別是非水相中的酶促合成酯類(lèi)的反應(yīng)[5-6]。非水酶促合成方法，不僅反應(yīng)條件溫和、效率高、專(zhuān)一性強(qiáng)，而且不易造成環(huán)境污染，可極大程度地克服化學(xué)合成法的缺點(diǎn)[7]。但酶催化過(guò)程中的酶活性和穩(wěn)定性，仍然需要進(jìn)一步的提高。本文基于脂肪酶的界面活化機(jī)制，選用假單胞菌脂肪酶（lipase，PCL）為生物催化劑，通過(guò)物理吸附，在柱形玻璃瓶中將PCL固定在脫脂棉上，形成一種簡(jiǎn)易的固定化酶生物反應(yīng)器，用于催化肉桂醇與乙酸乙烯酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。相對(duì)于脂肪酶粉，這種生物反應(yīng)器表現(xiàn)出較好的非水催化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

假單胞菌脂肪酶（PCL，33 U/mg）購(gòu)于杭州創(chuàng)科生物科技有限公司，肉桂醇為化學(xué)純?cè)噭ā?8%），乙酸乙烯酯、石油醚和正己烷皆為分析純，醫(yī)用脫脂棉購(gòu)于市場(chǎng)。固定化操作和催化反應(yīng)在搖床（HZQ-X恒溫?fù)u床，哈爾濱）中進(jìn)行。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析使用氣相色譜法（GC，儀盟A90，上海），色譜儀配有氫火焰檢測(cè)器和毛細(xì)管柱（SE-30，30 m×0.32 mm×0.33 μm）。酶構(gòu)象分析使用紅外光譜分析儀（I R Affinity-1，蘇州）。

1.2 脫脂棉預(yù)處理

取約5 g脫脂棉置于100 mL的干凈燒杯中，加入無(wú)水乙醇將脫脂棉完全浸沒(méi)，在室溫下放置1～2 d后，將脫脂棉取出并置于干凈的燒杯中，用紗布將燒杯口封住，自然晾干，晾干后用鑷子將其撕成蓬松狀備用。

1.3 PCL的固定化

參考以前的研究[8-9]，PCL 用量為10 mg。選用10 mL 的柱形玻璃瓶作為固定化容器。加入10 mg PCL 酶粉和0.2 mL 的蒸餾水，待酶粉完全溶解后，加入脫脂棉，使脫脂棉充分吸附酶液，再將柱型玻璃瓶固定在搖床中，敞口，在37 ℃和160 r/min下保持6 h，恰好可以使酶吸附在脫脂棉上，得到脫脂棉固定化酶PCL，簡(jiǎn)稱(chēng)脫脂棉固定化PCL，它和柱形瓶一起形成一個(gè)簡(jiǎn)易的脫脂棉固定化酶反應(yīng)器。

1.4 酶促轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

在脫脂棉固定化PCL酶反應(yīng)器中，加入肉桂醇（1.34 g，10 mol）與乙酸乙烯酯（2 mL，21.6 mol），蓋上蓋子，封口膜密封，在37 ℃、160 r/min的條件下催化反應(yīng)。PCL酶粉催化反應(yīng)時(shí)，在10 mL柱型玻璃瓶中，加入10 mg酶粉，其他反應(yīng)條件相同。如果重復(fù)使用酶催化反應(yīng)，可以將反應(yīng)液倒出，用少許正己烷清洗，后加入新的反應(yīng)液，在上述反應(yīng)條件下反應(yīng)。

1.5 酶動(dòng)力學(xué)分析

定期量取2 μL反應(yīng)液，用1 mL正己烷稀釋?zhuān)?.25 μm 濾膜過(guò)濾，進(jìn)行GC 分析。色譜條件為：氮?dú)猓?.4 MPa，分流比1∶1），130 ℃，保留1 min；20 ℃/min，210 ℃，保留5 min；60 ℃/min，280 ℃，保留2 min。進(jìn)樣和檢測(cè)溫度分別為280 ℃和 300 ℃。通過(guò)比較肉桂醇和乙酸肉桂酯的峰面積得出。底物的摩爾轉(zhuǎn)化率[10]，肉桂醇和乙酸肉桂酯的保留時(shí)間分別為3.8 min、4.7 min。

1.6 紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法[11]，PCL與溴化鉀混合壓片，若是使用過(guò)的PCL，用正己烷洗滌，待溶劑揮發(fā)后，再與溴化鉀混合壓片，用于紅外分析。如果是固定化酶，先將固定有PCL的棉纖維在溴化鉀中研磨，后將棉纖維取出，再做壓片。紅外光譜使用IRsolution 1.50SU1軟件解卷積，用Origin 8.5分析酰胺Ⅰ帶，采用二次導(dǎo)數(shù)自動(dòng)尋峰和Gaussian曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適脫脂棉用量

為確定脫脂棉的最佳用量，PCL為10 mg時(shí)，分別稱(chēng)取不同質(zhì)量的脫脂棉，在10 mL柱型玻璃瓶中進(jìn)行PCL的固定化，用于催化肉桂醇與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，通過(guò)GC分析，得出酶促轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，如圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫脂棉用量為15 mg時(shí)，酶促催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)效果相對(duì)較好。脫脂棉用量不足時(shí)，轉(zhuǎn)化底物的能力相對(duì)較低，原因是沒(méi)有足量的棉纖維充分分散酶蛋白。而脫脂棉用量過(guò)多，棉纖維會(huì)阻礙底物分子的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致底物分子不能充分與酶蛋白接觸。所以，在后續(xù)試驗(yàn)中，選用15 mg脫脂棉進(jìn)行固定化并進(jìn)行相應(yīng)的研究。制備的脫脂棉固定化酶PCL與柱形玻璃瓶一起形成了一種簡(jiǎn)易的固定化酶生物反應(yīng)器，如圖2。

圖1 不同脫脂棉用量下的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

圖 2 固定化酶PCL生物反應(yīng)器示意圖

注：1：瓶壁；2：吸附在瓶壁上的少量PCL；3：脫脂棉固定化PCL（表面吸附PCL的脫脂棉）；4：棉纖維間間隙；5：搖動(dòng)條件下流動(dòng)的反應(yīng)液

2.2 固定化酶與酶粉的活性比較

與酶粉相比較，脫脂棉固定化PCL的催化動(dòng)力學(xué)曲線明顯較高，如圖 3。催化反應(yīng)初期，2 h后，固定化酶和酶粉催化的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率分別為40.1%和15.2%，前者是后者的2.6倍。12 h后，轉(zhuǎn)化率分別為92.0%和35.3%，前者仍然是后者的2.6倍。表明固定化PCL酶反應(yīng)器的催化活性不僅顯著高于PCL酶粉，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶反應(yīng)器的活性沒(méi)有明顯降低，說(shuō)明反應(yīng)器中的脫脂棉固定化酶在有機(jī)相中是比較穩(wěn)定的[12 ]。

圖 3 脫脂棉固定化PCL酶與PCL酶粉在不同條件下的動(dòng)力學(xué)

注：◆脫脂棉固定化PCL，37 ℃、160 r/min；◇脫脂棉固定化PCL，37 ℃、0 r/min；▲脫脂棉固定化PCL，25 ℃、0 r/min；□脫脂棉固定化PCL，4 ℃、0 r/min；■PCL酶粉，37 ℃、160 r/min

2.3 靜置和低溫下酶反應(yīng)器活性

加入反應(yīng)液的脫脂棉固定化PCL反應(yīng)器，在37、25、4 ℃下，保持靜置，仍然保持優(yōu)良的催化活性（圖3）。在37 ℃，靜置條件與160 r/min條件相比，靜置時(shí)的脫脂棉固定化PCL的催化活性幾乎沒(méi)有明顯的降低，這可能是因?yàn)槊撝蘩w細(xì)的纖維狀結(jié)構(gòu)使之有較大的比表面積，非常有利于PCL酶蛋白的分散，有效地降低了酶的擴(kuò)散限制。加之棉纖維的柔韌性，有利于與液相充分接觸。因此，在靜置時(shí)，這種固定化PCL依然有很高的催化活性。在25 ℃室溫靜置條件下，這種反應(yīng)器的活性依然比較理想。反應(yīng)12 h后反應(yīng)液的GC顯示，靜置條件下，在溫度為37 ℃和25 ℃時(shí)，反應(yīng)器中底物已經(jīng)絕大部分被轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率分別為88%和84%，與37 ℃和160 r/min條件下轉(zhuǎn)化率（92%）相比，靜置條件沒(méi)有對(duì)轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生較大影響，而且都明顯高于37 ℃和160 r/min條件下酶粉催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率（35%）。

如圖4顯示，催化12 h后，37（25）℃和靜置條件，與37 ℃和160 r/min相比較，固定化酶依然能將絕大部分肉桂醇轉(zhuǎn)化為乙酸肉桂酯。即使在4 ℃，靜置的這種反應(yīng)器的催化活性仍高于酶粉在37 ℃、160 r/min條件的活性（圖3）?？梢?jiàn)，脫脂棉固定化PCL酶反應(yīng)器是一種低碳生物反應(yīng)器，有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖 4 酶促轉(zhuǎn)酯反應(yīng)12 h后反應(yīng)液的色譜圖

注：1：肉桂醇；2：乙酸肉桂酯；A：脫脂棉固定化PCL，37 ℃、160 r/min；B：脫脂棉固定化PCL，37 ℃、0 r/min；C：脫脂棉固定化PCL，25 ℃、0 r/min；D：脫脂棉固定化PCL，4 ℃、0 r/min

2.4 固定化酶非水穩(wěn)定性

脫脂棉固定化PCL和PCL酶粉的重復(fù)催化反應(yīng)試驗(yàn)表明，再次使用時(shí)，它們的催化活性有所降低，見(jiàn)表 1。在重復(fù)使用3次，每次6 h，共18 h，比較反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率降低值，脫脂棉固定化PCL催化的反應(yīng)中，轉(zhuǎn)化率平均每小時(shí)降低0.3%，PCL酶粉催化反應(yīng)中，轉(zhuǎn)化率平均每小時(shí)降低0.5%。說(shuō)明固定化酶的非水穩(wěn)定性較好。

表1 脫脂棉固定化PCL和PCL酶粉轉(zhuǎn)化底物的能力（使用3次，每次6 h）

注：n：轉(zhuǎn)化率；：每小時(shí)轉(zhuǎn)化降低率；=（13）/12

通過(guò)對(duì)PCL酶粉和脫脂棉固定化PCL的紅外光譜的去卷積處理，再用origin 8.5軟件進(jìn)行二次求導(dǎo)尋峰，并用Gaussian方程曲線擬合，得出如圖5所示的擬合曲線。從圖5可以看出，代表蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的酰胺I帶[5,13-15]在有機(jī)體系中有明顯的變化。

圖 5 PCL酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）Gaussian擬合曲線

注：A：PCL酶粉使用前酰胺I帶擬合曲線；B：PCL酶粉使用18 h后酰胺I帶擬合曲線；C：固定化酶使用前酰胺I帶擬合曲線；D：固定化酶使用18 h后酰胺I帶擬合曲線

在有機(jī)反應(yīng)體系中使用18 h后，PCL酶粉的-螺旋含量變化較小，-折疊含量明顯降低，降低10.8%，轉(zhuǎn)角含量也降低約3.3%，無(wú)規(guī)卷曲含量增加了約13.5%；脫脂棉固定化PCL在使用前，相對(duì)于酶粉構(gòu)象發(fā)生了明顯的變化，-螺旋和-折疊的總量有所增加，在使用18 h后，雖然無(wú)規(guī)卷曲含量增加了6.9%，轉(zhuǎn)角含量降低了5.3%，-折疊含量降低了19.1%，但-螺旋含量增加了17.5%，（表 2）。上述構(gòu)象的變化，說(shuō)明PCL酶粉的構(gòu)象不夠穩(wěn)定，而脫脂棉固定化PCL的構(gòu)象，在使用中雖然有較大變化，但有序構(gòu)象卻保持了較高的含量，說(shuō)明脫脂棉有助于維持脂肪酶的有序結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)酶抗有機(jī)溶劑的變性作用。因而，在重復(fù)使用過(guò)程中，固定化酶的活性降低較少，表現(xiàn)出較好的非水催化活性和穩(wěn)定性。

表2 有機(jī)體系對(duì)脫脂棉固定化PCL構(gòu)象的影響

注：表中小寫(xiě)字母a表示平行式折疊（反平行式折疊）

3 結(jié)論

研究證明，相對(duì)于酶粉，脫脂棉固定化PCL酶反應(yīng)器非水催化活性有明顯提高。說(shuō)明脫脂棉是一種較為理想的固定化載體，它如同水/油界面上的水分子，可以在非水條件下有效地穩(wěn)定酶蛋白，使其保持優(yōu)勢(shì)蛋白構(gòu)象，表現(xiàn)出優(yōu)良的非水催化活性和較好的穩(wěn)定性。靜置條件下，脫脂棉固定化PCL酶反應(yīng)器仍然保持優(yōu)良的催化活性，說(shuō)明棉纖維的結(jié)構(gòu)非常有利于降低酶的擴(kuò)散限制，這種酶反應(yīng)器具有低碳條件催化特性。固定化酶的重復(fù)應(yīng)用表明，相對(duì)于酶粉，其非水穩(wěn)定性有所增加。紅外光譜酰胺Ⅰ帶的分析顯示，脫脂棉固定化脂肪酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)于酶粉，其有序性較高，在有機(jī)體系中使用18 h后，雖然二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大改變，但二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性依然較高，說(shuō)明脫脂棉固定化酶PCL有較大的非水穩(wěn)定性。

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責(zé)任編輯：宗淑萍

Synthesis of cinnamyl acetate in an immobilized-lipase bioreactor

ZHOU Mei-juan1, ZHANG Ying1, CONG Fang-diCorresponding Author, ZHANG Shu-lin2,LIU Li-yao1, LUO Wei1

（1. College of Basic Sciences, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Key Lab of Aqua-ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

To improve the synthetic effect of cinnamyl acetate,lipase was immobilized on cotton fibers in a column glass bottle to form a facile bioreactor and used to catalyze transesterification between cinnamyl alcohol and vinyl acetate. The results were that the bioreactor could transform 92% of substrate after 12 h at 37 ℃ and 160 r/min while native lipase only gave a conversion of 35% under the same reaction conditions. Even at static state, the bioreactor brought high conversions, which were 88%, 84% and 44% after 12 h at 37, 25 and 4 ℃, respectively. In repeated 6 h catalysis, the immobilized and native lipases exhibited that the decrease rates in ability of transforming substrate were 0.3% and 0.5% per hour. It showed that the immobilized lipase in bioreactor behaved activity and stability higher than native lipase in the non-aqueous phase, which was also so at static state. This meant that it was a type of effectively low-carbon immobilized lipase bioreactor.

cinnamyl acetate; lipase; absorbent cotton; enzyme activity; enzyme stability

TS 201.3

A

1008-5394（2018）01-0064-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.014

2017-05-31

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410061136）；天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（TJAE201502）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170442）

周美娟（1993-），女，本科在讀，從事非水相酶催化方面的研究。E-mail：1138816897@qq.com。

叢方地（1968-），男，教授，博士，從事生物催化方面的研究。E-mail：congfangdi@163.com。