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(1.西華大學食品與生物工程學院，食品生物技術重點實驗室,四川成都 610039; 2.理縣塔斯酒莊有限公司,四川阿壩藏族羌族自治州 623100; 3.日本國際農(nóng)業(yè)科學研究中心,日本筑波 30528686)

冰酒是采用結冰的葡萄經(jīng)過壓榨、低溫發(fā)酵而釀造的葡萄酒,其酒體呈金黃色透明狀,果香濃郁,風味獨特,具有美容、養(yǎng)顏、保健等功效[1-2]。目前,全球冰酒產(chǎn)地有德國、奧地利、瑞士、加拿大和中國,而川藏高原是我國冰酒的主要產(chǎn)區(qū)之一[3],具有“海拔高、日照強、溫差大”等氣候優(yōu)勢。在冰酒的釀造過程中,酵母菌種的選擇至關重要,影響酒的品質(zhì)和香氣。市售釀酒酵母菌劑大多為葡萄酒通用酵母,若用于釀造冰酒,所得產(chǎn)品將喪失冰酒特有風味[4],所以冰酒釀造專用菌劑的研發(fā)就顯得尤為重要。將冰葡萄中分離純化獲得的酵母菌種所生產(chǎn)菌劑用于釀造冰酒,不僅發(fā)酵過程得以精準控制[5],還能保持冰酒獨特的風味,釀出高品質(zhì)的冰酒。

目前,國內(nèi)外菌劑制備的主要方式為真空冷凍干燥法和噴霧干燥法,真空冷凍干燥法制得的菌劑活菌率高,但干燥時間長,成本高,干燥物料為塊狀[6],噴霧干燥法生產(chǎn)菌劑雖時間短,但產(chǎn)品活菌率較低。本研究采用真空冷凍噴霧干燥法制備川藏高原冰酒專用發(fā)酵菌劑,所需干燥時間短,生產(chǎn)成本低,干燥物料為粉末狀,復水性強,保持了產(chǎn)品的生物活性[7-10]。實驗優(yōu)化了冰酒發(fā)酵菌劑的保護劑配方,并對最優(yōu)配方下所制備的菌劑進行性能分析,為川藏高原冰酒發(fā)酵菌劑標準化生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)從冰葡萄渣中分離得到[11],編號為JH2,保存于四川省微生物資源平臺菌種保藏中心(SSIC);酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖無水,成都科龍化工試劑廠;甘油、蔗糖、麥芽糊精(食品級)康達食品工程有限公司;脫脂乳粉完達山乳業(yè)股份有限公司。

BKD-126M實驗室噴霧冷凍干燥機上海雅程儀器設備有限公司;SRK-14D電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智域分析儀器制造有限公司;LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;JSM-7500F電子顯微鏡日本電子株式會社;IMP-Apollo熱重分析儀Shimadzu Kyoto Japan。

1.2　實驗方法

1.2.1菌種活化、富集活化:取保存的釀酒酵母甘油管一支,吸取1 mL加入裝有10 mL無菌 YPD培養(yǎng)基的試管中,放于28 ℃搖床培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)蘸取上述活化后的菌懸液,在虎紅瓊脂上劃線,28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d,待用。

富集:將上述活化后的釀酒酵母,按4%接種量加到YPD培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)48 h后,4500 r/min、4 ℃離心20 min,收集沉淀,即為所富集菌體[12]。

1.2.2冰酒發(fā)酵菌劑真空冷凍噴霧干燥制備工藝在預實驗基礎上,實驗優(yōu)化得到4種保護劑,通過單因素和正交實驗來優(yōu)化保護劑配方,提高菌劑活菌率。將富集菌體和各種濃度的保護劑按1∶4的體積比混合后,磁力攪拌30 min,混合均勻,同時打開真空冷凍噴霧干燥機進行預冷,待當前物料溫度為-40 ℃時,將混合溶液噴成小冰晶狀進入真空冷凍噴霧干燥機,進行升華干燥,干燥后即為粉末狀的菌劑[13-14]。

1.2.3復合保護劑單因素實驗本實驗中選取甘油、蔗糖、脫脂乳粉和麥芽糊精4種保護劑作為菌劑的保護劑,固定甘油的實驗水平為4%,蔗糖實驗水平為6%,脫脂乳粉實驗水平為10%,麥芽糊精實驗水平為14%。分別改變甘油添加量(2%、4%、6%、8%、10%)、蔗糖添加量(2%、4%、6%、8%、10%)、脫脂乳粉添加量(4%、6%、8%、10%、12%)、麥芽糊精添加量(10%、12%、14%、16%、18%),經(jīng)過真空冷凍噴霧干燥制成菌劑,以菌劑的活菌率為評價指標,確定各保護劑的較優(yōu)濃度。

1.2.4正交實驗根據(jù)孟憲軍[15]、張帆[16]的相關研究,復合保護劑的效果優(yōu)于單一保護劑。結合單因素實驗結果,對甘油、蔗糖、脫脂乳粉和麥芽糊精4種保護劑進行L9(34)正交實驗,以活菌率為評價指標,優(yōu)化復合保護劑配方,正交實驗因素和水平見表1。

表1　正交實驗因素和水平Table 1　Experimental factor and level of orthogonal test

1.2.5菌劑活菌率測定參考張帆[15]等的方法,并作一定的改進,冰酒發(fā)酵菌劑的活菌率計算公式為:

活菌數(shù)測定:參照GB 4789.15-2010進行測定[17]。

1.2.6菌劑性能分析在最優(yōu)復合保護劑配方下,對冰酒發(fā)酵菌劑進行性能分析。

1.2.6.1微觀形態(tài)分析用掃描電鏡來觀察發(fā)酵菌劑的微觀形態(tài)[18]。在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼上雙面膠,將菌劑樣品粘貼在雙面膠上,然后鍍膜觀察;電壓為15 kV,放大倍數(shù)為100和1000。

1.2.6.2熱失重分析將菌劑樣品放置在剛玉坩堝中,進行熱失重分析,升溫速度為10 ℃/min,初溫30 ℃,終溫400 ℃,記錄熱失重曲線[19]。

1.2.6.3熱穩(wěn)定性分析稱取0.1 g菌劑產(chǎn)品至9.9 mL無菌蒸餾水中,分別置于40、50、60 ℃水浴鍋中水浴20 min,每10 min進行一次活菌計數(shù)。

1.2.6.4低溫穩(wěn)定性分析稱取0.1 g菌劑產(chǎn)品至9.9 mL無菌蒸餾水中,分別放置在4 ℃和10 ℃中,保持12周,每4周進行一次活菌計數(shù)[20];同時,稱取0.1 g菌劑產(chǎn)品至9.9 mL無菌的YPD液體培養(yǎng)基中(事先放入杜氏小管),置于4 ℃和10 ℃培養(yǎng)14 d,每天觀察菌劑產(chǎn)氣情況并記錄結果。

1.2.6.5發(fā)酵性能挑選大小均一,無機械損傷的冰葡萄,破碎后取汁,將葡萄汁轉(zhuǎn)移到6個發(fā)酵罐中,每個發(fā)酵罐中500 mL。將冷凍噴霧干燥制得的冰酒發(fā)酵菌劑和市售安琪酵母菌劑按0.1 g的接種量分別接種到對應發(fā)酵罐中,并加入發(fā)酵液總體積1.5%的蔗糖溶液,加蓋密封,3個平行為一組。將上述接種酵母后的發(fā)酵罐放入15 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵,隔天定時測量其酒精度、總糖和總酸含量。

1.2.6.6冰酒品質(zhì)分析方法酒精度:采用酒精計直接測定[21];總糖:采用手持糖度儀測定[21];總酸:采用酸堿滴定法[22]。

1.3　數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析,采用SPSS 20.0進行顯著性分析、Origin 9.0作圖。

2　結果與分析

2.1　單因素實驗結果

2.1.1甘油添加量對菌劑活菌率的影響甘油又稱丙三醇,常用作防凍劑、保濕劑以及溶劑等[23],從圖1可知,在真空冷凍噴霧干燥時,甘油在釀酒酵母微膠囊化中保護作用明顯,隨著添加量的增加,菌劑的活菌率逐漸升高,當添加量超過4%時,隨著添加量的增加活菌率反而下降。主要原因可能在于:當甘油添加量小于4%時,隨添加量的增加,菌懸液的黏性增強,酵母菌細胞內(nèi)外的滲透壓相近,在升華干燥時,減緩細胞失水的速度,從而起到保護作用,增加酵母存活率[24]。當甘油添加量超過4%時,菌懸液水分含量較高,黏度較大,難以干燥為粉末狀的微膠囊,而是黏稠狀,影響細胞的存活。因此,甘油添加量4%時,微膠囊菌劑的活菌率為34.98%,達到最大值。

圖1　不同甘油添加量對菌劑活菌率的影響Fig.1　Effect of glycerol content on survival rate of yeast agents

2.1.2蔗糖添加量對菌劑活菌率的影響蔗糖除了作為甜味劑,還是一種冷凍結晶改良劑以及膨松劑,其玻璃化溫度較高,只能透過細胞壁,不能透過細胞膜,在微生物菌劑升華干燥過程中可保護細胞免受損傷,提高產(chǎn)品活菌數(shù)。如圖2,當蔗糖添加量為6%時,酵母菌劑活菌率顯著(p<0.05)高于其余各實驗組;當添加量小于6%時,隨著蔗糖濃度增加,菌劑產(chǎn)品活菌率不斷增加;當添加量大于6%時,菌劑產(chǎn)品的活菌數(shù)隨著濃度增加反而下降。這可能由于:添加量增加,蔗糖融化后,菌懸液黏度增加,影響細胞壁的通透性,經(jīng)真空冷凍噴霧干燥后,不能使菌懸液完全干燥成粉末狀,所以發(fā)酵菌劑的活菌率反而下降[25]。

圖2　不同蔗糖添加量對菌劑活菌率的影響Fig.2　Effect of sucrose content on survival rate of yeast agents

2.1.3脫脂乳粉添加量對菌劑活菌率的影響脫脂乳粉是將鮮牛奶脫去脂肪后再干燥而成的粉末狀產(chǎn)品,蛋白質(zhì)是其主要成分,將其作為菌劑真空冷凍噴霧干燥時的保護劑,能使菌劑產(chǎn)品具有較優(yōu)的呈粉性和復水性[26],在釀酒酵母菌體周圍形成一層外壁,具有保護作用。從圖3可知,當脫脂乳粉添加量小于10%時,隨著其濃度增加,微膠囊產(chǎn)品中釀酒酵母的活菌率不斷上升;當添加量超過10%后,菌劑產(chǎn)品的活菌率反而下降。因為,在脫脂乳粉添加量為10%時,其對酵母菌的保護效果已經(jīng)達到最大值,菌劑活菌率顯著(p<0.05)高于其余各添加量,若繼續(xù)提高濃度,則干燥產(chǎn)品中脫脂乳粉所占比例將會增加,活菌率反而下降。所以從節(jié)約成本角度出發(fā),選擇10%為脫脂乳粉較優(yōu)添加量。

圖3　不同脫脂乳粉添加量對菌劑活菌率的影響Fig.3　Effect of skimmed milk powder content on survival rate of yeast agents

2.1.4麥芽糊精添加量對菌劑活菌率的影響麥芽糊精是以各類淀粉為原料經(jīng)酶解、提純和干燥制成,具有良好的溶解性,不易潮解,是微膠囊制備中的較好載體。從圖4可知,在麥芽糊精添加量低于14%時,隨著其濃度增加,微膠囊產(chǎn)品中釀酒酵母的活菌率不斷上升;當添加量超過14%后,菌劑產(chǎn)品的活菌率反呈下降趨勢。在麥芽糊精添加量為14%時,其對酵母菌的保護效果差異顯著(p<0.05),活菌率達到最大值，所以,選取14%為麥芽糊精的較優(yōu)添加量。

圖4　不同麥芽糊精添加量對菌劑活菌率的影響Fig.4　Effect of maltodextrin content on survival rate of yeast agents

2.2　正交實驗結果

根據(jù)單因素實驗結果,按表1的實驗因素和水平進行了L9(34)正交實驗,實驗結果如表2、表3所示。

表3　方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment results

注：“*”表示對菌劑產(chǎn)品活菌率影響顯著,p<0.05。

表2　發(fā)酵菌劑保護劑配方優(yōu)化正交實驗設計及結果Table 2　Orthogonal array design and results for formula optimization of wall material

從表2和表3可知,4個因素對菌劑產(chǎn)品活菌率影響的主要順序為:脫脂乳粉>麥芽糊精>甘油>蔗糖,其中脫脂乳粉對產(chǎn)品活菌率的影響顯著(p<0.05)。從直觀分析來看,菌劑產(chǎn)品最佳保護劑組合為A3B1C3D2,極差分析而言,菌劑產(chǎn)品最佳保護劑組合為A3B3C3D3,通過多次驗證實驗,組合A3B3C3D3的活菌率為78.25%,活菌數(shù)為10.34 CFU/g,高于組合A3B1C3D2。所以冰酒發(fā)酵菌劑復合保護劑的最優(yōu)配方為A3B3C3D3,即甘油5%,蔗糖7%,脫脂乳粉11%,麥芽糊精15%。

2.3　性能分析

2.3.1微觀形態(tài)分析圖5為冰酒發(fā)酵菌劑在電子顯微鏡下的微觀形態(tài)。由圖可知,菌劑呈細小顆粒狀,無結塊現(xiàn)象發(fā)生;顆粒表面光滑且平整,保護效果較好,沒有高溫干燥而形成的微孔、褶皺。由此可見,添加最佳配方的復合保護劑后,對菌劑的微觀形態(tài)起到了較好的保護作用。

圖5　菌劑的微觀結構Fig.5　Microstructure of yeast agents注：A:100倍；B:1000倍。

2.3.2熱失重分析冰酒發(fā)酵菌劑的失重曲線如圖6所示。菌劑的熱失重分為三個階段:第一,菌劑預熱階段,質(zhì)量變化較平緩,溫度范圍為37～200 ℃,此時菌粉質(zhì)量損失較少,所供熱量主要用于菌粉的加熱;第二,菌劑中蔗糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解,大量揮發(fā)階段,質(zhì)量隨溫度和時間呈直線下降,溫度范圍為200～340 ℃,質(zhì)量分數(shù)從89.14%下降到40.54%;第三,菌劑質(zhì)量穩(wěn)定階段,此時加熱溫度為350 ℃。整體看來,菌劑在240 ℃時質(zhì)量分數(shù)仍然大于70%,說明制備的菌劑在240 ℃下是較穩(wěn)定的,質(zhì)量損失較少。

圖6　菌劑的TG曲線Fig.6　TG curve of yeast agents in optimum protective agents

2.3.3熱穩(wěn)定性分析菌劑周圍環(huán)境溫度過高可能會導致其含有的菌種失活,選擇適宜的保護劑可提高其對熱的抵抗能力,保持菌種活性。不同熱處理溫度下對菌劑活菌數(shù)的影響如圖7所示,在40、50、60 ℃下分別處理20 min后,菌劑中的活菌數(shù)從初始的10.51 CFU/g分別下降到了10.26、7.21、5.81 CFU/g。在40 ℃下,菌劑中活菌數(shù)下降了0.25 CFU/g,致死率僅為2.38%;50 ℃下,菌劑活菌數(shù)下降了3.30 CFU/g,致死率為31.39%。由此可見,該菌劑產(chǎn)品在40～50 ℃的高溫下,其活菌數(shù)仍保持較高,致死率較低,對高溫環(huán)境的抵抗性較強。

圖7　不同熱處理溫度對菌劑活菌數(shù)的影響Fig.7　Effect of heat treatments on viable counts of yeast agents

表5　冰酒發(fā)酵菌劑與市售釀酒酵母發(fā)酵性能對比Table 5　Comparison of fermentation performance between ice wine fermentation agents and commercially available Saccharomyces cerevisiae

2.3.4低溫穩(wěn)定性分析冰酒是在10～15 ℃低溫發(fā)酵而來的,冰酒發(fā)酵菌劑應能耐低溫,在低溫下仍能發(fā)酵,所以考察冰酒發(fā)酵菌劑的低溫穩(wěn)定是必要的。如圖8所示,在4 ℃和10 ℃下分別放置12周后,菌劑產(chǎn)品中的活菌數(shù)從初始的10.46 CFU/g分別下降到了6.99、8.92 CFU/g,致死率分別為33.17%和14.72%。從表4可知,菌劑中的釀酒酵母在10 ℃培養(yǎng)溫度下,第5 d時能開始發(fā)酵;第7 d開始大量發(fā)酵,所產(chǎn)生氣泡大于半管;第9 d時,所產(chǎn)生的氣泡充滿整個杜氏小管。由此可見,該發(fā)酵菌劑在10 ℃低溫下活菌數(shù)保持較高,且仍能發(fā)酵產(chǎn)氣,適用于釀造冰酒。

圖8　不同低溫處理對菌劑活菌數(shù)的影響Fig.8　Effect of low temperature on viable counts of yeast agents

表4　菌劑低溫穩(wěn)定性Table 4　Low temperature stability of yeast agents

注：“-”表示管內(nèi)無氣泡;“+”表示氣泡量小于半管;“++”表示氣泡量大于半管;“+++”表示氣泡滿管。

2.3.5發(fā)酵性能采用冰酒發(fā)酵菌劑釀造的冰酒與市售安琪酵母釀造而成的冰酒性能對比如表5所示,分別記錄冰酒在發(fā)酵過程中的酒精度、總糖和總酸。

酒精度、總糖和總酸是衡量果酒品質(zhì)的重要因素,酒精能抑制微生物生長,防止雜菌破壞酒的品質(zhì),酸度能賦予冰酒清新的品嘗感,給上顎一種煥然一新的感覺。從酒精度來看,發(fā)酵到第9 d時,兩種酵母發(fā)酵的冰酒酒精度趨于穩(wěn)定,發(fā)酵結束時,冰酒專用菌劑釀造的冰酒酒精度為(14.20±0.04)%v/v,與市售冰酒酒精度接近,而市售安琪酵母所釀造的冰酒酒精度為(15.12±0.03)%v/v,遠高于市售冰酒酒精度,酒味過于濃烈;從總糖和總酸含量來看,接種冰酒發(fā)酵菌劑后,冰酒在釀造過程中總糖下降趨勢平緩,總酸含量上升和下降幅度較小,酸甜比例適宜,口感細膩,而接種安琪酵母后的冰酒總糖含量下降迅速,總酸含量變化較大,酸甜比略微失調(diào)。由此可見,冰酒專用菌劑在釀造冰酒過程中其發(fā)酵效果優(yōu)于市售安琪酵母。

3　結論

以冰葡萄渣中分離的釀酒酵母為菌種,以甘油、蔗糖、脫脂乳粉和麥芽糊精為保護劑,運用真空冷凍噴霧干燥法制備冰酒專用發(fā)酵菌劑。通過單因素和正交實驗,得到菌劑復合保護劑的最優(yōu)配方為:甘油5%,蔗糖7%,脫脂乳粉11%,麥芽糊精15%,在此工藝條件下,制得的冰酒發(fā)酵菌劑活菌數(shù)為10.34 CFU/g,活菌率達到78.25%。再將此工藝條件下的冰酒發(fā)酵菌劑從微觀形態(tài)、熱失重、熱穩(wěn)定性、低溫穩(wěn)定性和發(fā)酵性能五方面進行性能分析,結果表明,該菌劑呈粉末狀,顆粒表面光滑平整,無褶皺、微孔出現(xiàn),保護效果較好;其熱失重也較穩(wěn)定,在240 ℃的高溫下,質(zhì)量損失小于30%;熱穩(wěn)定性和低溫穩(wěn)定性均較優(yōu),40 ℃下致死率僅為2.38%,在10 ℃的低溫下能進行發(fā)酵產(chǎn)氣,活菌數(shù)為8.92 CFU/g;在釀造冰酒的過程中,其發(fā)酵性能優(yōu)于市售安琪酵母。由此看來,添加最優(yōu)配方的復合保護劑后,經(jīng)真空冷凍噴霧干燥法制備出的冰酒專用發(fā)酵菌劑性能較優(yōu),適用于冰酒的釀造。

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