薛 慧，陳乃耀，張海霞，趙俊暕

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，河北唐山 063000

腦梗死(cerebral infarction，CI)作為威脅人類健康的常見病，不僅嚴(yán)重影響患者的預(yù)期壽命和生活質(zhì)量，還會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。探討腦梗死疾病環(huán)境和遺傳等相關(guān)影響因素，早期篩選易感人群，是一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究表明，載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)作為主要的載脂蛋白之一，對維持體內(nèi)脂質(zhì)水平的恒定起重要作用[1]，其基因多態(tài)性的表達(dá)及特殊的分子功能與血脂水平及心腦血管疾病有著密切的關(guān)系[2-5]。本文探討唐山地區(qū)漢族人群ApoB基因7673C/T、11039G/A多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系，從遺傳學(xué)角度分析可能引起腦梗死的危險(xiǎn)因素，為腦梗死易感人群的篩選和早期預(yù)防提供參考。

對象和方法

1 研究對象 選取2016年6 - 12月本院住院的初發(fā)腦梗死患者90例，男52例，女38例，平均年齡(58.86±6.15)歲，均為長期生活在唐山地區(qū)的漢族人，個(gè)體之間無血緣關(guān)系，均經(jīng)CT和(或)MRI確診(符合全國第四次腦血管疾病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn))。選取同一時(shí)期健康體檢者82例為對照組，男47例，女35例，平均年齡(57.71±5.96)歲，除外心腦血管疾病、糖尿病、血液病、傳染性疾病、自身免疫系統(tǒng)等疾病。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2 基因組DNA的提取 抽取研究對象清晨空腹靜脈血，EDTA抗凝管收集，參照美國Axygen公司血液基因組DNA試劑盒的操作步驟提取樣本DNA。

3 PCR-RFLP檢測基因多態(tài)性 參照GeneBank(http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Genbank)提供的人類基因組中DNA的ApoB基因序列和相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，ApoB C7673T引物：上游GGAGACTATTCA GAAGCTAA，下游GAAGAGCCTGAAGACTGACT；ApoB G11039A引物：上游TCTCGGGAATATTCAG GAACTATTG，下游CTAAGGATCCTACAATGTCAA GGT。PCR擴(kuò)增體系：Template 10 μl，上下游引物各 1.0μl，2×Master Mix 12.5 μl，ddH2O 0.5 μl，總體積25 μl。PCR循環(huán)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)后72℃再延伸5 min，4℃恒溫保存。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XbaⅠ酶切，電泳譜上出現(xiàn)710 bp片段為野生純合子CC型，出現(xiàn)433 bp和277 bp兩條片段為突變純合子TT型，同時(shí)出現(xiàn)以上3條片段為突變雜合子CT型(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切，電泳譜上出現(xiàn)395 bp和85 bp兩條片段為野生純合子GG型，僅出現(xiàn)480 bp片段為突變純合子AA型，同時(shí)出現(xiàn)以上3條片段則為突變雜合子GA型(圖2)。

圖1 7673C/T酶切產(chǎn)物電泳圖1、 4、 5、 7、 8為CC型； 2、 3、 6為CT型Fig. 1 7673C/T digestion products electro phoresis 1, 4, 5, 7, 8 for CC type; 2, 3, 6 for CT type

圖2 11039G/A酶切產(chǎn)物電泳圖2、 3、 4、 7為GG型； 5、 6、 8為GA型；1為AA型Fig. 2 11039G/A digestion products electrophoresis 2, 3, 4, 7 for GG type; 5, 6, 8 for GA type; 1 for AA type

4 血脂指標(biāo)的檢測 抽取研究對象清晨空腹靜脈血，促凝管收集，常溫離心，分離血清，應(yīng)用bayer1650全自動生化測定儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、 三 酰 甘 油 (triacylglycerol，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、ApoA、ApoB水平。

5 分析指標(biāo) 比較兩組血脂水平、基因型和等位基因分布，分析腦梗死危險(xiǎn)因素。

6 統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS13.0軟件包，基因計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型和等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組血脂水平比較 腦梗死組TC、TG、LDL、ApoA、ApoB水平均明顯高于對照組(P＜0.05)，HDL水平明顯低于對照組(P＜0.05)。見表1。

2 兩組7673C/T和11039G/A基因型和等位基因分布 腦梗死組出現(xiàn)7673C/T突變基因型和等位基因的頻率高于對照組(P＜0.05)，提示隨著T等位基因的增加，腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)可能增加；兩組11039G/A GG、GA+AA基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，腦梗死組出現(xiàn)突變A等位基因的頻率高于對照組(P＜0.05)。見表2。

表1 兩組血脂水平比較Tab. 1 Comparison of blood lipid indicators between two groups

表2 兩組7673C/T和11039G/A基因型和等位基因分布Tab. 2 Genotype and allele distribution of 7673C/T and 11039G/A between two groups (n, %)

3 腦梗死危險(xiǎn)因素分析 以腦梗死為因變量，高血壓、吸煙、飲酒、血脂各項(xiàng)指標(biāo)、7673C/T基因型、11039G/A基因型為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示高血壓、吸煙、TG、7673C/T CT基因型進(jìn)入模型，是腦梗死的危險(xiǎn)因素；11039G/A GA+AA基因型則未進(jìn)入模型，不是腦梗死的危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 腦梗死危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析Tab. 3 Logistic regression analysis of risk factors of cerebral infarction

討 論

隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成，腦血管疾病相關(guān)基因的定位和識別已經(jīng)成為功能基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。目前，在腦血管疾病基因的研究中，載脂蛋白是較受關(guān)注的一組，其基因多態(tài)性可影響血脂代謝[6]，而血脂異常與心腦血管疾病[7-9]、動脈粥樣硬化和心腦血管疾病均密切相關(guān)[10]。

ApoB作為主要的載脂蛋白之一，位于2號染色體的短臂(2P23)，長約43 kb，由29個(gè)外顯子和28個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。XbaⅠ酶切位點(diǎn)是由于ApoB基因cDNA序列上第7673位堿基發(fā)生C→T的突變，使2 488位密碼子改變(ACC→ACT)所致。多數(shù)研究認(rèn)為ApoB基因7673C/T多態(tài)性與血脂異常[11]、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病有著密切的聯(lián)系[12-14]。Boekholdt等[15]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)含有T等位基因人群血清的TC、LDL水平較高。我們分析，7673C/T多態(tài)性可能因?yàn)镃→T突變，影響了血清TG水平，從而增加了腦梗死的易感性，成為腦梗死發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素。

MspⅠ酶切位點(diǎn)是由于ApoB基因cDNA序列上第11 039位堿基發(fā)生G→A的突變，使3 611位密碼子改變(CGG→CAG)，精氨酸被谷氨酰胺取代。ApoB基因11039G/A多態(tài)性分布具有種族差異[16]。Stepanov等[17]和Rantala等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，A位基因頻率分別為0.111、0.057；我們的研究發(fā)現(xiàn)，唐山地區(qū)漢族人群A等位基因頻率為0.018，顯著低于白種人，存在種族差異。眾多學(xué)者對ApoB基因RFLP與腦梗死的關(guān)系進(jìn)行了研究，多數(shù)認(rèn)為腦梗死組ApoB基因不含有MspⅠ酶切位點(diǎn)的頻率高于對照組，但11039G/A多態(tài)性是否是腦梗死的危險(xiǎn)因素尚無明確結(jié)論。我們的研究發(fā)現(xiàn)ApoB基因11039G/A多態(tài)性不是腦梗死的危險(xiǎn)因素，但該基因是否與其他基因多態(tài)位點(diǎn)存在連鎖關(guān)系或通過其他途徑參與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，ApoB基因多態(tài)性可能通過影響血脂代謝，成為參與心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素。但目前對載脂蛋白B基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)機(jī)制和研究結(jié)論尚未統(tǒng)一，可能與研究樣本量、分組標(biāo)準(zhǔn)、種族差異、基因間的連鎖關(guān)系等因素有關(guān)，需要進(jìn)一步研究，以更好地了解腦梗死發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對臨床疾病的早期檢測及預(yù)防提供重要指導(dǎo)意義。

1 Al-Bustan SA， Alnaqeeb MA， Annice BG， et al. Genetic association of APOB polymorphisms with variation in serum lipid profile among the Kuwait population［J］. Lipids Health Dis， 2014， 13 ： 157.

2 濮田， 于海奕， 徐明，等. 未接受降脂治療的冠心病患者APOB基因多態(tài)性與危險(xiǎn)因素的交互作用［J］. 中華心血管病雜志，2017， 45（5）：386-392.

3 李美勇， 王倩， 齊曉明， 等. APOB、APOC-Ⅰ和LDLR基因多態(tài)性與血脂水平的關(guān)聯(lián)性分析［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016，38（17）： 1948-1953.

4 Cao Y， Fan X， Zhu W， et al. Association of C7673T polymorphism in apolipoprotein B gene with ischemic stroke in the Chinese population ： a meta-analysis［J］. Int J Neurosci， 2016， 126（7）：584-592.

5 Abd El-Aziz TA， Mohamed RH. LDLR， ApoB and ApoE genes polymorphisms and classical risk factors in premature coronary artery disease［J］. Gene， 2016， 590（2）： 263-269.

6 張宇， 魏丹丹， 元榮榮，等. ApoE 基因多態(tài)性對阿托伐他汀治療高脂血癥療效的影響［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志， 2017， 97（4）：291-294.

7 Lange KS， Nave AH， Liman TG， et al. Lipoprotein（a） Levels and Recurrent Vascular Events After First Ischemic Stroke［J］. Stroke，2017， 48（1）： 36-42.

8 Albers JJ， Slee A， Fleg JL， et al. Relationship of baseline HDL subclasses， small dense LDL and LDL triglyceride to cardiovascular events in the AIM-HIGH clinical trial［J］. Atherosclerosis， 2016，251： 454-459.

9 Park MH， Kim N， Lee JY， et al. Genetic loci associated with lipid concentrations and cardiovascular risk factors in the Korean population［J］. J Med Genet， 2011， 48（1）： 10-15.

10 Yaghi S， Bernstein RA， Passman R， et al. Cryptogenic Stroke：Research and Practice［J］. Circ Res， 2017， 120（3）： 527-540.

11 Gu W， Zhang M， Wen S. Association between the APOB XbaI and EcoRI polymorphisms and lipids in Chinese： a meta-analysis［J］.Lipids Health Dis， 2015， 14 ： 123.

12 Gallegos-Arreola MP， Valdez Y， Zú?iga-Corona M， et al.Association between the Xba I polymorphism of APOB gene and plasma lipid level in Mexican patients with coronary artery disease ［J］.Asia Pac J Clin Nutr， 2012， 21（2）： 312-318.

13 Li YY. ApoB gene SpIns/Del， XbaI polymorphisms and myocardial infarction ： a meta-analysis of 7169 participants［J］. J Cardiovasc Med （Hagerstown）， 2014， 15（9）： 717-726.

14 陳業(yè)達(dá)， 林美華， 譚藝青，等. 中國人群ApoB XbaI基因位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病關(guān)聯(lián)性的Meta分析［J］. 國際遺傳學(xué)雜志， 2015，38（6）：335-343.

15 Boekholdt SM， Peters RJ， Fountoulaki K， et al. Molecular variation at the apolipoprotein B gene locus in relation to lipids and cardiovascular disease： a systematic meta-analysis［J］. Hum Genet， 2003， 113（5）：417-425.

16 謝金衛(wèi)， 張文超， 張磊， 等 . 中國漢族 apoB 基因 EcoRI、XbaI、MspI、Ins/Del及3＇端VNTR位點(diǎn)的多態(tài)性研究［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2014， 14（30）： 5849-5854.

17 Stepanov VA， Puzyrev VP， Karpov RS， et al. Genetic markers in coronary artery disease in a Russian population［J］. Hum Biol，1998， 70（1）： 47-57.

18 Rantala M， Rantala TT， Savolainen MJ， et al. Apolipoprotein B gene polymorphisms and serum lipids： meta-analysis of the role of genetic variation in responsiveness to diet［J］. Am J Clin Nutr， 2000， 71（3）：713-724.