王昕凝，孫雪峰，祖 強(qiáng)，盧錦山，黃 銀，董 雋解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 0085；解放軍總醫(yī)院 腎病科，北京 0085；國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京)數(shù)據(jù)科學(xué)課題組，北京 006

尿液是血液經(jīng)過腎小球?yàn)V過及腎小管和集合管重吸收、分泌后產(chǎn)生的一種體液，其組成成分與腎生理及病理變化密切相關(guān)，也與機(jī)體整體代謝狀態(tài)相關(guān)[1]。因此，腎移植受者尿液蛋白組分變化可以反映移植腎生理狀態(tài)[2]。本研究的目的是運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法檢測移植腎正常受者及其相應(yīng)供者的尿液蛋白質(zhì)組差異，探討功能正常的移植腎與健康腎是否存在差異。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 研究納入了5對(duì)于2010 - 2014年在解放軍總醫(yī)院行腎移植術(shù)后3年以上的腎移植受者及其相應(yīng)供者，供受者關(guān)系均為父母-子女關(guān)系。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)活體供腎，供受者均無明顯全身或泌尿系統(tǒng)疾??；2)受者接受腎移植術(shù)后3年以上；3)受者未發(fā)生明確的慢性或急性排異反應(yīng)。所有腎移植受者均采取三聯(lián)免疫抑制治療方案：潑尼松+麥考酚嗎乙酯+他克莫司。所有供受者均于解放軍總醫(yī)院行尿常規(guī)、血常規(guī)、肝腎功能、B超等相關(guān)檢查以排除全身或泌尿系統(tǒng)疾病。

2 標(biāo)本收集及處理 收集10例受試者晨尿。取1 ml尿液加入2 ml超速離心管中，室溫下2 000×g離心75 min，棄去上清；向離心管中加入50μl懸浮緩沖液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L蔗糖，pH 8.5)，室溫放置15 min，之后加入2.5μl 1 mmol/L二硫蘇糖醇，混勻65℃加熱30 min；向離心管中加入200μl清洗緩沖液(10 mmol/L TEA，100 mmol/L NaCl，pH 7.4)，2 000×g離心30 min，棄去上清，向棄去上清的離心管內(nèi)加入30μl消化緩沖液(50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.5)， 之 后加 入 500 ng測序級(jí)胰酶(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega)，混勻后在37℃孵育4 h消化蛋白；所得肽樣品用于后續(xù)的質(zhì)譜分析。

3 液相質(zhì)譜分析 消化后所得肽樣品用20 μl的上樣緩沖液(5%甲醇，0.1%甲酸)溶解，然后取5μl上樣，利用ThermoScientific的納升級(jí)液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(nLC-Easy1000-Q Exactive-HF)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot2.3搜索引擎Proteome Discoverer V2.0進(jìn)行肽序列數(shù)據(jù)庫搜索分析。所用數(shù)據(jù)庫為美國生物技術(shù)信息國家中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的人類蛋白質(zhì)參考序列數(shù)據(jù)庫。并利用DAVID對(duì)分析得到的差異蛋白列表進(jìn)行GO富集分析，P＜0.05即表示差異蛋白在該GO條目中出現(xiàn)了富集。采用IPA通路數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白列表進(jìn)行生物通路分析，P＜0.05即表示差異蛋白在該通路條目中出現(xiàn)了富集。

結(jié) 果

1 供受者一般情況 所有供受者均接受供腎切取術(shù)及腎移植術(shù)3年以上，且均為父母供腎-子女受腎關(guān)系，至隨訪時(shí)無明顯全身或泌尿系統(tǒng)疾病。供受者一般情況見表1。

2 尿蛋白質(zhì)組差異蛋白 我們在所有尿樣本中共檢測出465個(gè)肽段≥1的特異蛋白，有12個(gè)蛋白在每對(duì)供受者中均存在差異。在腎移植受者尿液中高表達(dá)的蛋白有8個(gè)，分別為二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶3、碳酸酐酶4、視黃醇結(jié)合蛋白4、基底細(xì)胞黏附分子、過氧化物酶6、乳酸脫氫酶B、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3和絲氨酸蛋白酶抑制劑A1。腎移植受者尿液中低表達(dá)的蛋白有4個(gè)：細(xì)胞液泡蛋白質(zhì)分選因子4B、囊泡運(yùn)輸體1、Bro1包涵域蛋白及三肽氨基肽酶1。見表2。

3 差異蛋白GO功能注釋 我們對(duì)差異蛋白進(jìn)行了GO注釋分析。細(xì)胞組分注釋主要為細(xì)胞外分泌體、細(xì)胞外環(huán)境等。生理過程注釋主要包括急性期反應(yīng)、ESCRTⅢ復(fù)合體解聚、病毒生命周期等。分子功能注釋主要為蛋白結(jié)合作用。見表3。

4 差異蛋白參與通路分析 我們使用IPA通路數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物通路分析，差異蛋白主要參與的生物學(xué)通路包括急性期反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)傳導(dǎo)、三酰甘油降解等涉及免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝的生物學(xué)通路。見表4。

表1 供受者一般情況Tab. 1 Characteristics of donors and recipients

表2 受者與供者尿蛋白質(zhì)組間的差異蛋白Tab. 2 Distinct proteins between urine proteome of donors and recipients

表3 差異蛋白GO功能學(xué)注釋Tab. 3 GO terms of distinct proteins

表4 差異蛋白生物通路分析Tab. 4 Pathways of distinct proteins

討 論

尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的成熟可使我們對(duì)移植腎免疫反應(yīng)的病理生理學(xué)機(jī)制進(jìn)行探索[3-4]，同時(shí)也為尋找無創(chuàng)排異反應(yīng)特異性標(biāo)記物提供了良好的研究方法[5]。本研究中，我們對(duì)5對(duì)移植腎功能正常的受者及其相應(yīng)供者進(jìn)行尿蛋白質(zhì)組檢測及生物學(xué)功能分析。

我們在供受者尿液中共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)含量差異較大的蛋白，并對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行了GO注釋分析和生物學(xué)通路分析。GO注釋分析提示差異蛋白主要存在于細(xì)胞外液或血小板顆粒內(nèi)。尿液所含蛋白中，定位于細(xì)胞外的蛋白主要來源于泌尿系統(tǒng)對(duì)血漿的過濾、分泌作用，表達(dá)含量相對(duì)較穩(wěn)定；而定位于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)則主要由于腎、尿道、膀胱組織表皮脫落細(xì)胞衰老或者損傷導(dǎo)致細(xì)胞破損而釋放入尿液，這些蛋白相對(duì)而言表達(dá)不穩(wěn)定[6]。另外差異蛋白主要為結(jié)合蛋白，提示差異蛋白可能參與信號(hào)通路的傳導(dǎo)。生理過程分析提示，相關(guān)差異蛋白的生物學(xué)功能主要為物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)合體組件及參與免疫反應(yīng)。而差異蛋白參與通路主要為免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)通路。供受者尿液中蛋白質(zhì)含量差異可能與移植腎在受者體內(nèi)的生理變化有關(guān)。

國內(nèi)外有報(bào)道差異蛋白SERPINA3及其家族內(nèi)的其他蛋白(SERPINA1等)在急性排異反應(yīng)患者的體內(nèi)表達(dá)異常[7-13]。SERPINA家族蛋白是一種胰蛋白酶抑制劑，可以作用于包括絲氨酸蛋白酶在內(nèi)的多種靶點(diǎn)，而SERPINA3在體內(nèi)的表達(dá)異常與機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)移植物的排異反應(yīng)有關(guān)，抑制組織蛋白G的活性[14-15]，而組織蛋白酶G則是一種與排異反應(yīng)相關(guān)的粒細(xì)胞蛋白酶[16]。相比功能正常的腎移植受者，發(fā)生急性排異反應(yīng)受者尿液中SERPINA3明顯增高。賈雄飛等[17]對(duì)發(fā)生急性排異反應(yīng)的腎移植受者行尿蛋白質(zhì)組檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，SERPINA3前體在急性排異反應(yīng)受者尿液中明顯升高，且隨免疫抑制劑的應(yīng)用而逐漸降低，機(jī)制為控制CD8+T細(xì)胞的過度活化而增加了SERPINA3的合成及釋放。O'Riordan等[7]對(duì)急性排異受者及穩(wěn)定受者進(jìn)行了腎組織活檢后發(fā)現(xiàn)，二者腎組織中總SERPINA3含量并無明顯差異，考慮SERPINA3在尿液中的升高可能是其與靶向蛋白酶相互作用的結(jié)果，提示其靶向蛋白酶在急性排異反應(yīng)受者體內(nèi)活性升高；而Ziegler等[18]對(duì)腎移植術(shù)后急性排異反應(yīng)發(fā)生及治療后的血漿組分研究中發(fā)現(xiàn)，SERPINA3的C端片段對(duì)檢測排異反應(yīng)有著100%的敏感性及94%的特異性。本研究中我們所納入的移植腎正常的受者均無臨床排異反應(yīng)發(fā)生，但SERPINA3及SERPINA1在受者尿液中含量較供者升高，提示相關(guān)靶向蛋白活性在移植腎正常的受者體內(nèi)與健康腎有差異。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后受者與供者尿蛋白質(zhì)組存在差異，此差異主要與能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫反應(yīng)等生理功能有關(guān)。

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