王 丹，王旭輝,2，高興旺，李 冠

(1.新疆大學生物工程研究中心，烏魯木齊　830046；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院生物質(zhì)能源研究所，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL.)是世界十大水果之一，是中國、美國、西班牙、日本、法國、印度、韓國、中亞等多個國家和地區(qū)的重要經(jīng)濟作物[1]。老漢瓜是新疆甜瓜著名的地方品種之一，其葉片呈橢圓形。葉片作為植物進行光合作用的重要場所，能高效地將太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬?，為人類生存提供氧氣、食物、纖維、生物質(zhì)能源等[2]。葉片面積大小和葉片形狀均會對植物產(chǎn)量和品質(zhì)造成一定影響[3-6]，因此關(guān)于葉片發(fā)育分子機理的研究自然成為國內(nèi)外科學家關(guān)注的焦點之一[7-9]。研究前期以甜瓜掌狀裂葉自然突變體bm7為主要材料，將甜瓜掌狀裂葉候選基因pll定位到只有一個候選基因的范圍內(nèi)[10],并發(fā)現(xiàn)甜瓜葉片性狀受一對等位基因控制。為了進一步研究甜瓜掌狀裂葉形成的分子機理，實驗以老漢瓜為研究材料，該品種甜瓜葉形為全緣葉，與甜瓜掌狀裂葉性狀為等位性狀，將控制甜瓜全緣葉性狀的基因命名為PLL。實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對PLL基因進行敲除，利用該技術(shù)可為甜瓜掌狀裂葉候選基因的功能驗證奠定基礎(chǔ)，同時為甜瓜葉片形態(tài)分子建成的機制的揭示提供參考，在國內(nèi)外學術(shù)界也將具有重要的理論意義和學術(shù)價值?！厩叭搜芯窟M展】CRISPR/Cas是廣泛存在于古生菌以及細菌的基因組中的保守序列，屬于生物自身免疫系統(tǒng)，可對外來入侵的病毒或者質(zhì)粒起降解作用[11]。當有外源DNA侵染細菌時，細菌體內(nèi)自身的防御系統(tǒng)開始調(diào)控Crispr轉(zhuǎn)錄成為不成熟的crRNA，也就是前體RNA ，然后在Cas蛋白和核酸酶的作用下對前體RNA進行剪切和加工，使其形成含有spacer序列的crRNA,成熟的crRNA與tracrRNA形成復合物，此復合物引導Cas蛋白與crRNA配對的序列靶位點結(jié)合，對雙鏈DNA進行剪切，從而造成基因的突變，達到編輯效果[11]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)自2012年問世以來，顯示了強大的優(yōu)勢以及廣闊的應(yīng)用前景[12-14]。在動物方面，馬小婭等[12]利用CRISPR/Cas9對水牛的基因進行敲除，唐雨婷等[13]利用CRISPR/Cas9敲除了豬的β4GalNT2基因。在植物方面，F(xiàn)eng Z Y等[14]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了擬南芥幾個在功能缺失時有明顯的生長表型的內(nèi)源基因如GA應(yīng)答基因(GIBBERELLICACIDINSENSITIVE，GAI)，當GA基因被敲除以后，擬南芥植株表現(xiàn)出矮小的表型。除了模式植物擬南芥，禹明森等[15]成功建立生菜CRISPR/Cas9敲除體系，唐雨薇等[16]構(gòu)建了茶樹咖啡堿合成酶CRISPR/Cas9敲除載體。在葫蘆科作物中，國外科學家利用CRISPR/Cas9敲除了番茄的RIN基因[17]，該基因是一個轉(zhuǎn)錄因子，在果實成熟方面起著重要的作用，最終得到了51株突變體，這些突變體產(chǎn)生了不完全成熟的果實。與野生型比較，其紅色素沉淀也明顯降低。通過對三個獨立靶點產(chǎn)生的突變是否可以在T1后代中穩(wěn)定遺傳的研究發(fā)現(xiàn)，該突變體系產(chǎn)生的編輯效果可以穩(wěn)定遺傳給后代。因此，可以選擇利用CRISPR/Cas9對甜瓜全緣葉基因進行敲除，從而研究甜瓜裂葉基因的功能。目前在甜瓜中尚未有編輯成功的例子。實驗所使用的表達載體帶有潮霉素抗性基因，因此，需要對甜瓜耐受潮霉素的最大濃度進行檢測，為下一步的實驗打下基礎(chǔ)。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，抗潮霉素基因是最常用的標記基因之一，由于HPT基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)片段較小，約只有1.1 kb左右,其很容易與沒有選擇標記的目的片段結(jié)合并導入植物基因組[18]。其毒性機理是通過干擾植物細胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2的結(jié)合，從而對肽鏈的延長進行抑制。當潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)化到植株中時，它使轉(zhuǎn)化后的細胞或組織具有對潮霉素的抗性，而非轉(zhuǎn)化細胞和組織則不具備此抗性從而逐漸褐化、死亡，據(jù)此可初步篩選出轉(zhuǎn)化的細胞或組織。但因潮霉素是高毒性的物質(zhì)，對外植體的毒害作用較大，因此，需要研究其對外植體分化的影響來確定其使用濃度，這對下一步的遺傳轉(zhuǎn)化意義重大?！颈狙芯壳腥朦c】Crispr/cas在植物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使實驗有了基礎(chǔ)保障。因此，通過構(gòu)建甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas敲除載體來研究裂葉基因的功能。前期高興旺等[10]將甜瓜裂葉基因pll定位與甜瓜三號染色體上，并證明甜瓜裂葉性狀受隱性單基因控制。目前，尚未對甜瓜裂葉基因pll進行功能驗證，也未對其等位基因——甜瓜全緣葉基因PLL進行功能驗證。實驗的成功開展可為甜瓜裂葉性狀分子機制的揭示奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建新疆甜瓜CRISPR/Cas9基因編輯載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，檢測甜瓜對潮霉素的最大耐受濃度，為揭示甜瓜裂葉性狀的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

以新疆著名的甜瓜地方品種老漢瓜為實驗材料，實驗材料種植于新疆昌吉市試驗田。載體為植物敲除載體pP1C4。

1.2　方 法

1.2.1甜瓜全緣葉基因PLL敲除載體的構(gòu)建

1.2.1.1sgRNA靶位點引物設(shè)計

根據(jù)甜瓜基因組全序列，查找全緣葉基因MELO10784，根據(jù)其外顯子序列，設(shè)計敲除引物(引物設(shè)計網(wǎng)址為http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，設(shè)計一對20 bp左右的oligo DNA片段作為靶位點，根據(jù)靶位點設(shè)計其正反向引物,引物由北京華大基因合成，純化級別為PAGE。表1

1.2.1.2sgRNA 表達盒構(gòu)建

使用高保真的DNA聚合酶，以pP1C4載體為模板，利用特異性引物，通過PCR擴增獲得其對應(yīng)的sgRNA表達盒。

1.2.1.3線性化敲除載體制備

利用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI 對pP1C.4 載體進行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物進行凝膠電泳，然后切膠回收目的片段，回收片段約14 kb，回收產(chǎn)物OD260/OD280在1.8～2.0。

1.2.1.4重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將擴增后的PCR產(chǎn)物進行切膠回收，利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ對載體及PCR產(chǎn)物進行雙酶切，切膠回收目的條帶。然后利用重組酶將載體與目的片段進行連接構(gòu)建重組載體。采用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。

1.2.1.5陽性菌落鑒定及測序

以構(gòu)建好的載體為模板，U6p.4-F及載體下游通用引物gRNA-R作為檢測引物，進行PCR檢測，回收目的片段(pP1C.4 載體回收片段大小為400 bp左右)，再利用U6p.4-F作為測序引物，檢驗載體是否連接成功。

1.2.2潮霉素耐受性篩選

因載體所攜帶的抗性基因為潮霉素抗性基因，因此，需要對甜瓜耐受潮霉素的最大濃度進行檢測。首先對甜瓜種子進行表面消毒，先利用70%的乙醇消毒30 s,然后用2%的次氯酸鈉消毒7 min，將表面消毒的種子放置在MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)。萌發(fā)4 d后將葉片切下，將葉片左右兩邊切去，再將葉片分為8份，以不加潮霉素的培養(yǎng)基作為對照組，再設(shè)計5個濃度梯度，每個培養(yǎng)皿放40個葉片，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計愈傷組織生長情況，以及出芽情況，每組設(shè)3個重復。

2　結(jié)果與分析

2.1　全緣葉基因PLL敲除載體的構(gòu)建

2.1.1sgRNA靶位點引物設(shè)計

根據(jù)CRISPR/Cas9在線設(shè)計工具，參考軟件自帶評分參數(shù)，選擇GC含量高達60%且特異性較高的位點用與sgRNA載體的構(gòu)建，靶位點序列信息為GAAGTCCATGAATGATAATGAGG。研究所用引物均由軟件Primer Primer5.0設(shè)計，具體引物序列信息見表1。

表1引物序列信息
Table1Primer sequencing information

引物名稱Primername引物序列(5’-3＇)Primersequence用途FunctionU6p．4-FCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC擴增sgRNA，測序驗證FW-RGCTATTTCTAGCTCTAAAACCATTATCATTCATGGACTTCAATCACTACTTCGACTCT擴增sgRNAgRNA-RAGCACCGACTCGGTGCCAC陽性菌落驗證

2.1.2sgRNA表達盒的獲取

以pP1C.4載體為模板，通過特異性引物U6p.4-F，F(xiàn)W-R成功擴增到目的片段。圖1(1)，圖1(2)是全緣葉基因gRNA的PCR產(chǎn)物,以DL3000 DNA Marker為參照，成功克隆出了300 bp左右目的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收，經(jīng)測序驗證，成功獲得sgRNA表達盒。圖1

2.1.3線性化載體的制備

利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ對載體進行雙酶切，電泳后顯示條帶大小與預(yù)期一致，說明載體被成功酶切?；厥彰盖衅?，將回收條帶低溫保存?zhèn)溆谩?OD260/OD280的值為2.0)。圖2

2.1.4陽性菌落PCR檢測

將重組載體利用重組酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并進行鑒定，在含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上長出的大腸桿菌單菌落隨機挑取6個進行PCR檢測，結(jié)果得到約400 bp左右的片段，目的條帶明亮單一且符合預(yù)期，再將PCR產(chǎn)物進行測序，證明成功將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。圖3

注：1～2：sgRNA框；M：DL3000 DNA Marker

Note: 1-2;sgRNA frame M：DL3000 DNA Marker

圖1sgRNA表達盒的擴增
Fig.1Amplification of sgRNA

注：1～2:XbaⅠ,EcoR Ⅰ雙酶切后的載體片段；M:DL10K DNA Marker

Note: 1-2;XbaⅠ、EcoRⅠ Enzyme cut vector fragment; M:DL10K DNA Marker

圖2 雙酶切的載體片段
Fig.2 Enzyme cut vector fragment

注:1～6：陽性大腸桿菌；M:DL3000 DNA Marker

Note: 1-6:recombinant plasmid;M:DL3000 DNA Marker

圖3重組質(zhì)粒PCR鑒定
Fig.3PCR of recombinant plasmid

2.1.5陽性菌落測序鑒定

華大基因測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒成功插入了靶位點序列，含有靶位點的sgRNA片段與載體片段完全一致，證明成功構(gòu)建了甜瓜PLL基因敲除載體。圖4

圖4陽性菌落測序結(jié)果
Fig.4Sequencing results of positive colonies

2.2　潮霉素耐受性篩選

研究表明，當不加潮霉素時，愈傷組織均可長出，其生長率為100%。加入5 mg/L的潮霉素時雖然有41%的葉片長出了愈傷組織，但沒有發(fā)育成正常的單芽或者叢生芽。加入潮霉素濃度為10、15、20 mg/L的培養(yǎng)基中的葉片均沒有長出愈傷組織，且組織塊逐漸褐化，最終死亡。該結(jié)果說明甜瓜愈傷組織對潮霉素最大的耐受濃度為10 mg/L。表2

表2甜瓜對不同濃度潮霉素的耐受性檢測
Table2Tolerance detection of different concentrations of melon to Hygromycin

潮霉素濃度　Hygromycinconcentration(mg/L)05101520葉片總數(shù)Totalnumberofleaves(個)404040404040404040404040404040愈傷組織個數(shù)Numberofcallus(個)402200040130004014000

3　討 論

很多物種利用基因編輯技術(shù)進行了性狀改良，基因編輯的方法主要有巨核酶技術(shù)、鋅指合酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)和CRISPR相關(guān)的核酸酶技術(shù)[19]。這些技術(shù)均被應(yīng)用到多種基因工程相關(guān)的實驗中。但他們也有各自的缺點,相比于CRISPR相關(guān)的核酸酶技術(shù)，其余的基因編輯技術(shù)操作流程復雜，需要對相應(yīng)的酶進行改造才能識別靶位點序列從而產(chǎn)生編輯效應(yīng)。而利用CRISPR載體不需要那么繁瑣的改造，只需要構(gòu)建特異的sgRNA與Cas蛋白結(jié)合就可以對基因進行編輯，極大簡化了基因編輯的過程，相比較其他的方法在基因編輯方面具有更大的潛力。關(guān)于CRISPR/Cas9產(chǎn)生的突變效率問題一直是科學界關(guān)注的焦點之一，CRISPR/Cas9編輯效率受很多因素的影響，因此，可以從多方面去提高編輯效率。楊秀榮[20]利用BbsⅠ單酶對載體進行酶切并進行載體構(gòu)建。在該實驗中,利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ對載體及PCR產(chǎn)物進行雙酶切，然后利用重組酶將酶切后的載體與PCR產(chǎn)物進行連接，從而構(gòu)成一個完整的載體。楊學飛等[21]通過對利用單個酶切位點與兩個酶切位點的選擇時發(fā)現(xiàn)，利用BbSⅠ單酶切位點克隆到載體中，會使假陽性的概率升高，連接效率變低，通過改造將BbSⅠ酶切位點替換成AfeⅠ和XbaⅠ的酶切位點后，連接效率大幅度提高，出現(xiàn)假陽性的概率很小。因此,選用XbaⅠ、EcoRⅠ兩個酶切位點進行載體的構(gòu)建，從而降低假陽性的概率，提高連接和編輯效率。另一方面可以通過串聯(lián)多個sgRNA來提高編輯效率。劉丁源等[22]通過串聯(lián)多個sgRNA敲除擬南芥IAA2基因，結(jié)果表明，通過串聯(lián)多個sgRNA可以產(chǎn)生堿基插入突變以及大片段缺失突變等多種可遺傳突變。與單個 sgRNA相比，串聯(lián)多重sgRNA的基因敲除效率高、種系突變多。因此，在以后的工作中可以采取串聯(lián)多個sgRNA來提高編輯效率。

潮霉素在很多基因工程的實驗中作為篩選劑，王哲等[18]研究煙草 K326葉片直接誘導分化再生苗的潮霉素篩選濃度為5～20 mg/ L。王節(jié)之等[23]還研究了谷子對潮霉素的最大耐受濃度，發(fā)現(xiàn)愈傷組織從5 mg/L開始變黃，臨界抗性濃度不超過10 mg/L，同樣利用潮霉素作為篩選劑，檢測甜瓜對潮霉素最大耐受濃度，確定陽性植株的篩選濃度。通過檢測發(fā)現(xiàn)甜瓜對潮霉素的耐受濃度為10 mg/L。在潮霉素濃度為5 mg/L的時候，約有40%的葉片不會分化出愈傷組織，在潮霉素濃度達到10 mg/L的時候，所有的葉片均出現(xiàn)褐化，并逐漸死亡，這與顏雪等[24]的結(jié)果一致，顏雪等對伽師瓜耐受潮霉素的濃度進行檢測時，發(fā)現(xiàn)伽師瓜耐受潮霉素的最大濃度也為10 mg/L，因此，可以初步判定甜瓜一般可耐受潮霉素的最大濃度為10 mg/L。因此，在陽性植株檢測時，添加10 mg/L的潮霉素可初步篩選出陽性植株。

甜瓜在田間葉片形狀一般為橢圓形，但在田間發(fā)現(xiàn)裂葉突變體，其葉片與普通甜瓜種質(zhì)資源全緣葉不同，表現(xiàn)為掌狀裂葉的形態(tài)。利用SSR分子標記技術(shù)，通過圖位克隆策略已將pll基因定位到甜瓜基因組三號染色體上，通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)裂葉基因與全緣葉基因共同控制葉片的形狀，高興旺等對其進行了簡單的分析，但未對基因進行克隆，更未對其進行功能驗證。因此該研究利用CRISPR/Cas9構(gòu)建全緣葉基因的敲除載體，下一步利用凍融法將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，為進一步的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié) 論

結(jié)合甜瓜基因組序列數(shù)據(jù)構(gòu)建甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas9敲除載體，經(jīng)電泳及測序檢測，構(gòu)建了甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas9敲除載體，并確定了甜瓜對潮霉素的最大耐受濃度為10 mg/L?，F(xiàn)已將載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，經(jīng)菌落PCR檢測，已獲得陽性農(nóng)桿菌菌落，下一步進行甜瓜愈傷組織的轉(zhuǎn)化以期得到陽性植株，為揭示裂葉基因的功能打下堅實的基礎(chǔ)。

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