陳卓，毛祥,2，于華，唐平，黃丹，2*，趙長青,2

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢　643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢　643000；3.四川工業(yè)科技學(xué)院 食品與服裝學(xué)院，四川 德陽　618500)

四川麩醋是我國一種著名的食醋，主要以麩皮等為原料，采用多菌種、生料固態(tài)發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝[1]。它以藥曲和黑曲作糖化劑，再加上醋母和麩皮拌和后入池，發(fā)酵主要靠環(huán)境中的微生物進(jìn)行，其產(chǎn)品色澤黑褐、味道幽香、酸味柔和、體態(tài)澄清、可久存而不腐[2]。在食醋生產(chǎn)過程中，酵母菌、醋酸菌、霉菌、乳酸菌等都是優(yōu)勢菌，是主要的發(fā)酵劑[3]。因此，研究乳酸菌的產(chǎn)酸特性可以為后期提高食醋的出醋率奠定基礎(chǔ)。目前，對(duì)食醋釀造過程中的乳酸菌的研究比較活躍，Xu Wei等[4]在對(duì)鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中菌系分布的研究中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌和醋酸菌占主體地位。Wu Jiajia等[5]在研究山西老陳醋釀造過程中的菌系組成時(shí)，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬是酒精發(fā)酵階段的主要優(yōu)勢微生物。聶志強(qiáng)等[6]采用宏基因組學(xué)技術(shù)研究天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵過程中菌系組成，結(jié)果表明：隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌的豐度逐漸降低，但在整個(gè)發(fā)酵過程中乳酸菌的豐度遠(yuǎn)高于其他細(xì)菌，說明乳酸菌可能對(duì)食醋風(fēng)味形成具有重要作用。2014年趙國忠等從老陳醋酒醅中分離得到1株有利于食醋發(fā)酵的乳酸菌，通過菌株協(xié)同發(fā)酵，添加乳酸菌與未添加乳酸菌的醋醅進(jìn)行比較，前者乳酸含量提高了2.1倍；發(fā)酵結(jié)束后，總酸含量前者為6.37 g/100 g，后者為5.36 g/100 g。但是對(duì)四川麩醋中乳酸菌的研究報(bào)道還比較少，研究麩醋醋醅中乳酸菌的產(chǎn)酸特性可為解析麩醋風(fēng)味形成原因提供一些幫助。

本研究從四川麩醋醋醅中篩選出產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的優(yōu)勢乳酸菌，進(jìn)行分子鑒定，并對(duì)該菌株在不同發(fā)酵初始pH、溫度以及搖床轉(zhuǎn)速等條件下的產(chǎn)酸能力進(jìn)行研究，為解決麩醋出醋率低的問題提供幫助。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試驗(yàn)材料與試劑

醋醅，四川某傳統(tǒng)麩醋廠；CaCO3，HCl，NaOH，HOOCC6H4COOK等，以上藥品均為分析純。

1.1.2培養(yǎng)基

1.1.2.1分離培養(yǎng)基(MRS)

葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，吐溫80 1 mL，牛肉膏10 g，乙酸鈉5 g，酵母膏5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸錳0.25 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，瓊脂20 g，碳酸鈣20 g，蒸餾水1 L。121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基

在分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上不添加瓊脂和碳酸鈣。

1.1.3儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、pH計(jì)、搖床、電子顯微鏡、移液槍、紫外可見分光光度計(jì)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀。

1.2　方法

1.2.1菌株的分離純化

準(zhǔn)確稱量25 g醋醅樣品，加入到裝有225 mL無菌水的錐形瓶中，震蕩搖勻。取1 mL接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，目的是富集菌體。再吸取1 mL富集后的菌液，以10倍濃度法梯度稀釋到10-7，然后再選取適當(dāng)梯度的菌懸液并吸取1 mL于無菌培養(yǎng)皿中[7]，用含有2%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基澆注[8]，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察。依據(jù)乳酸菌形態(tài)特征和透明圈大小挑取單菌落。把得到的單菌落多次分離純化，直至獲得純培養(yǎng)，經(jīng)顯微鏡觀察確定為單菌落后接種到斜面，所得單菌落編號(hào)，保藏備用。

1.2.2菌株的復(fù)篩

分別將各分離菌株接種到裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。再用pH計(jì)法測定其總酸，依據(jù)總酸的含量來篩選出其中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.3分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

為了提取分離菌株的DNA，本試驗(yàn)主要采用凍融法[9]。

引物1(27f)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物2(1492r)：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

PCR反應(yīng)體系(25 μL體系)：

DdH2O11

10×PCR緩沖液2.5

2.5 mmol/L dNTP2.0

25 mmol/L MgCl21.5

引物11.0

引物21.0

模板DNA5

Taq酶1

反應(yīng)條件：

① 預(yù)變性95 ℃4 min

② 變性95 ℃45 s

③ 退火56 ℃45 s

④ 延伸72 ℃90 s

⑤ 終延伸 72 ℃1 min

重復(fù)②，③，④ 步驟35次，后再延伸1 min停止[10]。最后將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.4分離菌株同源性分析

將測序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對(duì)比，然后再將對(duì)比結(jié)果相似度在98%以上的DNA序列下載下來，保存為fasta格式，用MEGA6軟件對(duì)fasta文件進(jìn)行序列對(duì)比，最后制作成系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定所選菌株的種屬。

1.3　分離菌株產(chǎn)酸條件研究

1.3.1產(chǎn)酸曲線的測定

在無菌環(huán)境下用移液槍移取1 mL種子液到裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，37 ℃下培養(yǎng)。分別在0，4，8，12，16，20，24，28，32 h下測定酸度(以乳酸計(jì)，電位滴定法[11])，計(jì)算并記錄數(shù)據(jù)。以上述時(shí)間作為橫坐標(biāo)、產(chǎn)酸量作為縱坐標(biāo)，繪制得到分離菌株的產(chǎn)酸曲線，以確定后續(xù)試驗(yàn)中測定酸度的培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.2發(fā)酵初始pH對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響

接種 1 mL 種子液于初始 pH 分別為 3.5，5.0，6.5，8.0，9.5的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，140 r/min條件下培養(yǎng)28 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測定總酸，確定最適發(fā)酵初始pH。

1.3.3溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響

接種1 mL種子液于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中。分別于31，34，37，40，43 ℃，自然pH下140 r/min培養(yǎng)28 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測定總酸，確定最適溫度。

1.3.4轉(zhuǎn)速對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響

接種1 mL種子液于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別于120，130，140，150，160 r/min，自然pH和最適溫度下培養(yǎng)28 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測定總酸，并確定最適轉(zhuǎn)速。

2　結(jié)果與分析

2.1　分離菌株鑒定

2.1.1分離菌株初篩

在MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入2%的碳酸鈣做產(chǎn)酸指示，通過澆注平板法培養(yǎng)，挑取透明圈較大的細(xì)菌進(jìn)行劃線純化，最終篩選得到5株產(chǎn)酸細(xì)菌，分別編號(hào)B1，B2，B3，B4，B5。通過革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，可知分離菌株均為革蘭氏陽性桿菌。

2.1.2分離菌株復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下靜止培養(yǎng)24 h，搖勻后取一定量的發(fā)酵液測定總酸，結(jié)果見圖1。

圖1　5株菌的產(chǎn)酸結(jié)果Fig.1 Acid-producing result of five strains

由圖1可知，菌株B2產(chǎn)酸量最高，因此選擇菌株B2做后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

2.1.3分離菌株同源性分析

菌株DNA及PCR擴(kuò)增電泳圖分別見圖2和圖3。

圖2　DNA電泳圖Fig.2 DNA electrophoretogram

圖3　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoretogram of PCR amplified products

由圖2和圖3可知，菌株B2的DNA電泳圖存在一點(diǎn)拖尾的現(xiàn)象。

2.1.4分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對(duì)比，然后再將對(duì)比結(jié)果相似度在98%以上的DNA序列下載下來，保存為fasta格式，用MEGA6軟件對(duì)fasta文件進(jìn)行序列對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確分離菌株的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育地位，結(jié)果見圖4。

圖4　系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree

由圖4可知，分離菌株B2為鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。

2.2　分離菌株產(chǎn)酸條件研究

2.2.1分離菌株產(chǎn)酸曲線測定

分離菌株產(chǎn)酸曲線見圖5。

圖5　菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.5 Acid-producing curve of strain

由圖5可知，該菌株在32 h的培養(yǎng)中，總酸呈上升趨勢，但在28 h后上升平緩，趨于穩(wěn)定。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇培養(yǎng)28 h后測定總酸。

2.2.2發(fā)酵初始pH對(duì)分離菌株產(chǎn)酸的影響

pH對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響見圖6。

圖6　pH對(duì)菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.4 Effect of pH value on the acid-producing ability of bacteria strains

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為5.0時(shí)，該乳酸菌的產(chǎn)酸量最高，達(dá)到1.986 g/dL。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH<5.0時(shí)，乳酸菌的產(chǎn)酸能力下降，但不是很明顯；當(dāng)pH在中性或者偏堿性的條件下時(shí)，該乳酸菌的產(chǎn)酸能力卻快速下降，這表明在酸性條件下可能有利于該菌的生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。由此可知，因?yàn)樵邴煷揍勗爝^程中，環(huán)境pH基本上是偏酸性的，所以把該菌株用于釀造四川麩醋是可行的，具有依據(jù)的。

2.2.3溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸的影響

溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響見圖7。

圖7　溫度對(duì)菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.7 Effect of temperature on the acid-producing ability of bacteria strains

由圖7可知，溫度對(duì)于菌株的產(chǎn)酸能力影響較大，環(huán)境溫度從31～37 ℃時(shí)，分離菌株總酸呈上升趨勢，含量可達(dá)到1.725 g/dL；當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，菌株的產(chǎn)酸能力受到抑制，總酸下降到1.326 g/dL。這是因?yàn)闇囟忍邥?huì)影響菌株的生長，從而導(dǎo)致總酸含量下降。

2.2.4轉(zhuǎn)速對(duì)分離菌株產(chǎn)酸的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響見圖8。

圖8　轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.8 Effect of rotating speed on the acid-producing ability of bacteria strains

由圖8可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在140 r/min左右時(shí)，該菌株的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，總酸含量達(dá)到1.713 g/dL。當(dāng)轉(zhuǎn)速低于140 r/min時(shí)，總酸含量降低，這是由于供氧量減少不利于該菌株的生長。因?yàn)槿樗峋羌嫘詤捬跣途?，?dāng)轉(zhuǎn)速高于140 r/min時(shí)，供氧量增加會(huì)影響菌株發(fā)酵產(chǎn)酸，導(dǎo)致總酸含量下降，所以該菌株的最適搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)先從四川麩醋醋醅中篩選出

了5株產(chǎn)酸細(xì)菌，然后以產(chǎn)酸能力為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，選出產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株，并進(jìn)行同源性分析，最終確定了該菌株為鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。并研究該菌株在不同發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速下的產(chǎn)酸能力，結(jié)果表明該菌株的最佳產(chǎn)酸條件為初始pH5.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速140r/min，總酸含量1.986g/dL。

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