蒙禮娟，鄭博文，喬建雄，張選奮

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 整形美容外科，甘肅 蘭州 730030；2.昆明市兒童醫(yī)院 燒（創(chuàng)）傷整形外科，云南 昆明 650000）

皮膚老化的特征之一是透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）逐漸減少。HA具有保水和填充作用，多點(diǎn)注射進(jìn)入真皮層（即“水光注射”）已廣泛用于皮膚美容治療。然而，這種注射需要特殊設(shè)備和醫(yī)務(wù)人員操作，存在諸多不便。如何提高外用HA的滲透能力，以方便求美者或患者居家自助使用，是研究的熱點(diǎn)之一，對(duì)經(jīng)皮滲透給藥具有參考意義。經(jīng)皮滲透給藥的困難在于皮膚屏障嚴(yán)重限制大分子物質(zhì)進(jìn)入。微針[1]、電穿孔[2]、激光燒蝕[3]和化學(xué)促滲劑[4]等方法短期輕微破壞或改變皮膚屏障已被用于促進(jìn)物質(zhì)經(jīng)皮滲透。其中，微針穿刺最簡(jiǎn)便易行，且本身具有緊膚等美容作用。

微針針刺皮膚創(chuàng)建的微米級(jí)孔道，可使親水性和大分子物質(zhì)如siRNA[5]、疫苗[6,7]和胰島素[8,9]等穿過，從而發(fā)揮治療作用。在一定范圍內(nèi)，微針直徑和密度越大，物質(zhì)的透皮量越多。但是，微針直徑＞16G（約1650μm），則在人類皮膚遺留瘢痕，而微針密度＞2000/cm2時(shí)，“釘床效應(yīng)”使透皮量下降[10-13]?？傊つw上微孔的保持時(shí)間和愈合情況決定主藥的經(jīng)皮滲透量和臨床應(yīng)用。然而，滲透量最適的微針直徑和HA分子量等尚不清楚，我們作了研究。報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

TP-3A型ZTY智能透皮實(shí)驗(yàn)儀（鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司）；25G、22G、18G針頭（上?？档氯R企業(yè)發(fā)展集團(tuán)股份有限公司）；酶標(biāo)儀3001（Thermo SCIENTIFIC）；0.22μm微孔濾膜（上海密粒膜分離技術(shù)有限公司）。

1.2 材 料

試劑：10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa的HA（化妝 品 級(jí)， 批 號(hào)：1603221、1511103、1503103、1506112， 含 量 95.7%、95.9%、95.9%、96.0%，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司）；Rat HA ELISA KIT（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 試劑配制

1%HA溶液：精密稱取HA 0.050g，加PBS液5ml，靜置2h，玻璃棒充分?jǐn)嚢枞芙?，制?%HA溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 微針陣列模型的制備

將25G、22G和18G針頭，均勻刺入直徑為15mm的圓形橡膠片，密度為30針，尖端露出長(zhǎng)度700μm。用膠水將10ml注射器針筒與此橡膠片黏連固定，針筒內(nèi)灌入蠟汁，冷卻凝固，制成微針陣列模型（圖1）。

2.3 體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.3.1 離體皮膚和微針穿刺皮膚制備

離體皮膚制備：SD大鼠，10%水合氯醛（0.003ml/g）腹腔注射麻醉，剃眉刀剃去背部毛發(fā)，飼養(yǎng)48h拉頸處死，切取皮膚，修去皮下組織，生理鹽水反復(fù)沖洗，即為離體完整皮膚。生理鹽水紗布包裹，4℃冰箱保存，24h內(nèi)使用。

圖1 微針陣列模型 Fig1. Microneedle array model

微針穿刺皮膚制備：將離體完整皮膚裁成2.0cm×2.0cm大小，平鋪于泡沫板上，角質(zhì)層朝上，用不同型號(hào)微針陣列穿刺皮膚，即為微針穿刺皮膚。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以針頭型號(hào)G、HA分子量Mr和透皮時(shí)間T作為考察因素，每個(gè)因素4個(gè)水平，即G（無針頭、25G、22G、18G）、Mr（10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa）、T（1h、3h、5h、7h）， 依據(jù)正交表L16(45)，獲得16組實(shí)驗(yàn)組合。

2.3.3 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

采用改良Franz擴(kuò)散池，有效滲透面積約1.767cm2，接受室容積18.5ml。將離體完整皮膚和微針穿刺皮膚固定在供應(yīng)室與接受室之間，角質(zhì)層面向供應(yīng)室。接受室加PBS 18.5ml，供應(yīng)室加1%HA溶液0.5ml，保鮮膜封閉供應(yīng)室；雙重水浴循環(huán)，371℃恒溫，磁力攪拌器恒速30050 r/min攪拌。按正交實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，到指定時(shí)間點(diǎn)從接受室吸取接收液1.0ml。為了排除皮膚組織本身存在HA的影響，設(shè)空白對(duì)照組（空1h、空3h、空5h、空7h），空白組的供應(yīng)室加PBS 0.5ml。接收液用0.22μm濾膜過濾，用Rat HA ELISA KIT測(cè)定HA濃度。滲透量Q = CT－C空T，其中CT為每個(gè)正交實(shí)驗(yàn)組合的接收液濃度，透皮時(shí)間為T；C空T為空白對(duì)照組透皮T小時(shí)的接收液濃度。

2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 大鼠備皮和標(biāo)記

SD大鼠麻醉后，剃眉刀剃去背部毛發(fā)，用蘸有亞甲藍(lán)溶液的10ml注射器針筒印于背部剃毛區(qū)的脊柱兩側(cè)，每側(cè)3個(gè)，對(duì)稱分布（圖2a），飼養(yǎng)24h備用。

2.4.2 溶液外用方法

10ml注射器針筒邊緣用醫(yī)用膠布纏繞，制成容器，用膠水將容器沿標(biāo)記輪廓與皮膚粘住即可（圖2b），在針筒內(nèi)加入適量PBS液，觀察4h未見液體外滲（圖2c）。取皮時(shí)沿著針筒內(nèi)圈剪下皮膚組織。

圖2 a 大鼠標(biāo)記方法，b 容器固定方法，c PBS觀察漏液情況Fig.2 a、 Labeling method, b 、Container fixing method, c、Observation of leakage by using PBS

2.4.3 微針針刺后皮膚反應(yīng)觀察

SD大鼠麻醉后，75%酒精消毒2遍，脊柱兩側(cè)分別用22G、18G微針針刺，無菌生理鹽水濕紗布包扎，自然愈合0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、36h，2名無關(guān)專業(yè)人員分別觀察皮膚紅斑和水腫等反應(yīng)，選出最佳微針。

無紅斑（針眼周圍顏色同正常皮膚）記0分；輕微紅斑（針眼周圍可見線狀紅暈環(huán)）記1分；明顯紅斑（紅暈環(huán)小于1/3針距，覆蓋面積小于50%）記2分；重度紅斑（紅暈環(huán)小于1/3針距，但覆蓋面積大于50%；或針距間被紅暈環(huán)完全填充）記3分。

無水腫（平周圍正常皮膚）記0分；輕度水腫（水腫高度小于1/3針距，覆蓋面積小于50%）記1分；中度水腫（高度小于1/3針距，覆蓋面積大于50%）記2分；重度水腫（高度大于1/3針距）記3分。

最佳微針針刺后組織學(xué)觀察和HA經(jīng)皮滲透的時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)見圖3。微針針刺后，無菌紗布覆蓋，到每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，取開紗布，分別進(jìn)行下列操作。

組織學(xué)觀察：取全層皮膚行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。

圖3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)Fig.3 Design of time point in vivo experiment正常對(duì)照：無微針預(yù)處理正常皮膚外用HA；空白對(duì)照：無微針預(yù)處理正常皮膚外用PBS。

HA體內(nèi)透皮實(shí)驗(yàn)：按2.4.2中所述方法外用PBS液或HA溶液，滲透4h后，用PBS濕棉簽擦去皮面殘留的HA，切取全層皮膚，PBS液洗凈后，將皮膚和肉膜分開，各自稱重，按體重（g）：液體（ml）=1:4的比例加PBS液，350 r/min勻漿6min，吸取勻漿液，4℃、13000 r/min離心10min，分成脂肪層、透明液體層、組織層3層，吸取中間的透明液體層，上述條件反復(fù)離心4次，吸取待測(cè)液用0.22μm濾膜過濾，用Rat HA ELISA KIT測(cè)定樣本HA濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

正交設(shè)計(jì)軟件V3.1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。皮膚和肉膜中HA含量用（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本均數(shù)之間的比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié) 果

3.1 體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

針頭越粗、HA分子量越小、滲透時(shí)間越長(zhǎng)，HA的透過量增加（P＜0.05，表1、表2、圖4）。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

透過量較大的組合為“18G-10k-7h”、“18G-100k-5h”、“22G-10k-5h”、“22G-100k-7h”，考慮Mr越大，其降解速度越慢，效果越持久，Mr定為100kDa，當(dāng)T在3h～5h段，其透皮速率最大，所以將T定為4h，而G在22G或18G中根據(jù)針刺后皮膚的反應(yīng)情況選擇。

圖4 G、Mr、T的變化趨勢(shì)Figure.4 Changing trend of G、Mr and T隨著針頭的增粗，透過量增加，斜率變??；隨著分子量的增大，透過量減少，斜率變?。浑S著透皮時(shí)間的增加，透過量增加，在3～5h之間，斜率最大。

表1 G-Mr-T正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 G-Mr-T Orthogonal experimental results

3.2 微針針刺后皮膚反應(yīng)結(jié)果

各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分結(jié)果均為0分，無紅斑及水腫。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，微孔變小，22G針刺部位在15h愈合，而18G針刺部位到21h愈合，兩者到24h恢復(fù)正常皮膚形態(tài)（圖5）。為方便使用，HA的透皮時(shí)間在4h內(nèi)最佳，因此，最佳針頭選用22G，最優(yōu)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組合為“22G-100kD-4h”。

圖5 皮膚反應(yīng)及微孔愈合情況 Fig.5 Skin reaction and microporous healing22G微針針刺后15h基本愈合，而18G延遲到21h，兩者到24h恢復(fù)正常皮膚形態(tài)

3.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

22G微針針刺后皮膚屏障破壞，深達(dá)真皮乳頭層，隨著愈合時(shí)間的延長(zhǎng)，微孔變小。到18h，微孔被增生的表皮細(xì)胞覆蓋，皮膚屏障結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（圖6）。

圖6 皮膚愈合組織學(xué)觀察（HE×10） Fig.6 Histological observation of skin healing(HE×10)隨時(shí)間延長(zhǎng)，微孔收縮變小。到18h，微孔被表皮細(xì)胞覆蓋，皮膚屏障結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（箭頭指向微孔創(chuàng)面）。

3.5 HA在體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

22G微針針刺后經(jīng)過0h、3h、6h、9h、12h、15h，再涂抹HA并滲透4h，皮膚內(nèi)HA含量分別高于正常對(duì)照組1.29、1.24、1.14、1.05、1.03、1.01倍且隨著愈合時(shí)間延長(zhǎng)，HA量減少（P＜0.05，圖7），而針刺后愈合18h、21h、24h后，再涂抹HA并滲透4h，皮膚內(nèi)HA含量與對(duì)照組相同（P＞0.05，圖7）。正常對(duì)照組皮膚HA含量與空白對(duì)照組相同（P＞0.05，圖7）。

針 刺 后 經(jīng) 過 0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h后，涂抹HA、滲透4h，肉膜層HA含量沒有變化（P＞0.05，圖7）。

圖7 各時(shí)間點(diǎn)HA含量（n=5，a 皮膚 b 肉膜）Fig.7 HA content at each time point (n=5, a skin, b dartos)與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。0h組、3h組、6h組、9h組、12h組、15h組兩兩之間比較， P＜0.05。

4 討 論

透皮給藥是一種新型的給藥方式，因皮膚屏障，Mr＜500Da的物質(zhì)能夠透皮吸收[14]，促滲劑或非有創(chuàng)促滲透方法可使500 Da＜Mr＜1000 Da的物質(zhì)滲入皮膚[15]，而微針穿刺的微孔道則可以快速透過Mr＞10 kDa的大分子物質(zhì)如胰島素[8,9,16]、疫苗[6,7]和DNA[5,17]等，因此，微針是目前經(jīng)皮給藥技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。

微針促滲作用的影響因素很多。①、針頭外徑與透過量成正比。針頭越粗，形成的通道也粗，滲透速率就快。②、透皮量與滲透物質(zhì)的Mr成反比[18]。我們發(fā)現(xiàn)，隨著HA分子量增加，微針的促滲效果越差。③、儲(chǔ)庫中藥物的物理性狀有顯著影響：儲(chǔ)庫中的HA呈水溶液如Mr≤1000kDa時(shí)，滲透量大，而1500kDa的HA呈凝膠狀，滲透量就小。④、皮膚的活性和透皮時(shí)間也影響藥物經(jīng)皮滲透量。在無修復(fù)能力的離體皮膚，藥物迅速透過達(dá)到峰值后在穩(wěn)態(tài)維持[19]，但體內(nèi)皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)過程導(dǎo)致藥物以最大流速快速達(dá)到峰值，此后逐漸下降而無穩(wěn)態(tài)階段[19]。創(chuàng)傷修復(fù)過程包括皮膚組織彈性回縮、傷口收縮和增殖等，使微孔逐漸變小直至閉合，角質(zhì)層修復(fù)，皮膚屏障得以恢復(fù)。因此，皮膚創(chuàng)傷愈合過程嚴(yán)重影響微針促進(jìn)HA的透皮能力。我們的研究結(jié)果與此一致。⑤、微針的刺入深度不是影響透皮速率的決定因素[13,19,20]，但影響治療的舒適感。微針長(zhǎng)度多在600μm～800μm之間[21,23]，使用時(shí)僅刺入120μm～160μm，到真皮乳頭層，在皮膚屏障形成微小通道，但不損傷真皮乳頭層中的神經(jīng)和毛細(xì)血管，避免產(chǎn)生痛感和不適感，減輕炎癥反應(yīng)[24]。

微針?biāo)缕つw傷口愈合，皮膚屏障功能恢復(fù)，恢復(fù)的時(shí)間與微針的外徑密切相關(guān)。正常膚屏障僅允許經(jīng)皮水分流失（Transepidermal water loss,TEWL）約2～5 g·cm-2·h-1，以保持皮膚濕潤(rùn)、光滑、柔韌和彈性[25]。皮膚的完整性及屏障功能破壞時(shí)，TEWL值將升高。微針?biāo)聜谟线^程中，微孔逐漸縮小，TEWL降低，至傷口完全愈合時(shí)，TEWL恢復(fù)正常的基線水平[16,17,21-23,26-28]，但愈合時(shí)間主要由微針外經(jīng)決定。我們?nèi)庋塾^察發(fā)現(xiàn)22G微針穿刺皮膚后，傷口15h基本愈合，而18G微針到21h才基本愈合。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，22G微針針刺后3h，微孔的傷口內(nèi)形成纖維蛋白栓子。隨著愈合時(shí)間延長(zhǎng)，纖維蛋白栓子增多，從微孔底部向上填充，伴隨微孔縮小，表皮細(xì)胞增殖，逐漸覆蓋傷口，到18h，傷口完全被覆蓋，皮膚屏障實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)性恢復(fù)。

這一愈合過程決定HA透過量的變化。22G微針針刺后立即給予100kDa的HA外用4h，其透皮量大幅度增加；而經(jīng)過一定的愈合時(shí)間后再給予HA，其透過量逐漸下降，到18h后，未見明顯HA透過，而肉膜層HA含量未見變化，顯然與微針的結(jié)構(gòu)和HA的特性有關(guān)。微針僅穿刺到真皮淺層，HA經(jīng)皮膚微孔道滲透到達(dá)真皮層后，即發(fā)生水合作用，體積增加，起到填充和潤(rùn)澤皮膚的作用。

綜合上述，22G微針針刺后外用100kDa的HA滲透4h（3h～5h）的皮膚透過量最大，但HA無法滲透進(jìn)入肉膜層，且皮膚創(chuàng)傷反應(yīng)輕微，傷后18h內(nèi)愈合。提示22G微針針刺后外用100kDa的HA滲透4h（3h～5h）可以替代“水光注射法”給皮膚補(bǔ)充HA。

[1] Zhang Y, Brown K, Siebenaler K, et al. Development of lidocaine-coated microneedle product for rapid, safe,and prolonged local analgesic action[J]. Pharm Res,2012, 29 (1): 170-177.

[2] Hu Q, Liang W, Bao J, et al. Enhanced transdermal delivery of tetracaine by electroporation[J]. Int J Pharm, 2000, 202 (1-2): 121-124.

[3] Bachhav YG, Summer S, Heinrich A, et al. Effect of controlled laser microporation on drug transport kinetics into and across the skin[J]. J Control Release, 2010, 146 (1): 31-36.

[4] Trommer H, Neubert RH. Overcoming the stratum corneum:the modulation of skin penetration. A review[J]. Skin Pharmacol Physiol, 2006, 19 (2): 106-121.

[5] Deng Y, Chen J, Zhao Y, et al. Transdermal Delivery of siRNA through Microneedle Array[J]. Sci Rep, 2016, 6:21422.

[6] Kim MC, Lee JW, Choi HJ, et al. Microneedle patch delivery to the skin of virus-like particles containing heterologous M2e extracellular domains of influenza virus induces broad heterosubtypic crossprotection[J]. J Control Release, 2015, 210: 208-216.

[7] Hirobe S, Azukizawa H, Hanafusa T, et al. Clinical study and stability assessment of a novel transcutaneous influenza vaccination using a dissolving microneedle patch[J]. Biomaterials, 2015,57: 50-58.

[8] Harvey AJ, Kaestner SA, Sutter DE, et al. Microneedlebased intradermal delivery enables rapid lymphatic uptake and distribution of protein drugs[J]. Pharm Res, 2011, 28 (1): 107-116.

[9] Chen MC, Ling MH, Kusuma SJ. Poly-gamma-glutamic acid microneedles with a supporting structure design as a potential tool for transdermal delivery of insulin[J]. Acta Biomater, 2015, 24: 106-116.

[10] Mikszta JA, Alarcon JB, Brittingham JM, et al.Improved genetic immunization via micromechanical disruption of skin-barrier function and targeted epidermal delivery[J]. Nat Med, 2002, 8 (4): 415-419.[11] Teo MA, Shearwood C, Ng KC, et al. In vitro and in vivo characterization of MEMS microneedles[J].Biomedical Microdevices, 2005, 7 (1): 47.

[12] Ai LT, Shearwood C, Ng KC, et al. Transdermal microneedles for drug delivery applications[J].Materials Science & Engineering B, 2006, 132 (1–2):151-154.

[13] Yan G, Warner KS, Zhang J, et al. Evaluation needle length and density of microneedle arrays in the pretreatment of skin for transdermal drug delivery[J]. Int J Pharm, 2010, 391 (1-2): 7-12.

[14] Bos JD, Meinardi MM. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs[J]. Exp Dermatol, 2000, 9 (3): 165-169.

[15] 陳娟, 陳志鵬, 瞿敏明, 等. 微針技術(shù)在經(jīng)皮給藥中的應(yīng)用[J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2011, 38 (2): 142-147.

[16] Liu S, Jin MN, Quan YS, et al. The development and characteristics of novel microneedle arrays fabricated from hyaluronic acid, and their application in the transdermal delivery of insulin[J]. J Control Release, 2012, 161 (3): 933-941.

[17] Daugimont L, Baron N, Vandermeulen G, et al. Hollow microneedle arrays for intradermal drug delivery and DNA electroporation[J]. J Membr Biol, 2010, 236 (1):117-125.

[18] 尹東鋒. 基于陽離子聚合物/DNA納米復(fù)合物微針給藥系統(tǒng)的研究[D]. 第二軍醫(yī)大學(xué),2008.

[19] Milewski M, Paudel KS, Brogden NK, et al.Microneedle-assisted percutaneous delivery of naltrexone hydrochloride in yucatan minipig: in vitro-in vivo correlation[J]. Mol Pharm, 2013, 10(10): 3745-3757.

[20] Verbaan FJ, Bal SM, van den Berg DJ, et al. Assembled microneedle arrays enhance the transport of compounds varying over a large range of molecular weight across human dermatomed skin[J]. J Control Release, 2007,117 (2): 238-245.

[21] Kalluri H, Banga AK. Formation and closure of microchannels in skin following microporation[J].Pharm Res, 2011, 28 (1): 82-94.

[22] Kalluri H, Kolli CS, Banga AK. Characterization of microchannels created by metal microneedles:formation and closure[J]. Aaps j, 2011, 13 (3): 473-481.

[23] Kusamori K, Katsumi H, Sakai R, et al. Development of a drug-coated microneedle array and its application for transdermal delivery of interferon alpha[J].Biofabrication, 2016, 8 (1): 015006.

[24] 李偉澤, 張寒, 韓文霞, 等. 實(shí)體微針透皮給藥的安全性研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2011, (23).

[25] Tagami H, Kobayashi H, Zhen XS, et al. Environmental effects on the functions of the stratum corneum[J]. J Investig Dermatol Symp Proc, 2001, 6 (1): 87-94.

[26] Sawyer J, Febbraro S, Masud S, et al. Heated lidocaine/tetracaine patch (Synera, Rapydan) compared with lidocaine/prilocaine cream (EMLA) for topical anaesthesia before vascular access[J]. Br J Anaesth,2009, 102 (2): 210-215.

[27] Gupta J, Park SS, Bondy B, et al. Infusion pressure and pain during microneedle injection into skin of human subjects[J]. Biomaterials, 2011, 32 (28): 6823-6831.

[28] Katsumi H, Liu S, Tanaka Y, et al. Development of a novel self-dissolving microneedle array of alendronate, a nitrogen-containing bisphosphonate:evaluation of transdermal absorption, safety, and pharmacological effects after application in rats[J].J Pharm Sci, 2012, 101 (9): 3230-3238.