紅花中羥基紅花黃色素A的提取方法與含量測定研究進展

李 棟，馬秉智，梁瑩瑩，張淑君，張相林，赫 軍

（中日友好醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100029）

中藥紅花為菊科植物紅花 （Carthamus tinctorius L）的干燥花，是活血通絡(luò)、祛瘀止痛之良藥，臨床上主要用于治療痛經(jīng)、跌打損傷、冠心病、心絞痛和高血壓等[1]。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是紅花中最具藥理活性的水溶性成分，多年來一直是科研的熱點，臨床研究表明，其具有抗凝血、抗氧化、預(yù)防腦缺血、保護血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)等作用，是2015版中國藥典收錄紅花藥材的質(zhì)量控制指標成分之一[2，3]。其主要提取方法為滲漉法、水提醇沉法、超聲提取法等。本文綜述了近十幾年來HSYA的提取方法和含量測定方面的研究論文，以期為開發(fā)利用HSYA提供參考。

1 HSYA的提取方法

1.1 滲漉法

喻樊[4]以HSYA和紅花黃色素的含量作為評價指標，采用正交試驗優(yōu)選提取工藝，最佳提取條件是以60%乙醇浸漬12h，25倍量進行滲漉，滲漉流速為1ml/min。

1.2 水提法

李云云[5]通過正交實驗討論了提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比對提取效果的影響。實驗結(jié)果表明，影響因素的大小依次是提取時間、提取次數(shù)、提取溫度、料液比；最適宜提取條件是：溫度為45℃、時間為45min、料液比為1∶20，提取 2 次。

1.3 醇沉法

袁佳等[6]采用L9（34）正交試驗法，以HSYA轉(zhuǎn)移率、浸出物得率和純度為指標進行綜合評分，確定紅花提取液醇沉的最佳工藝條件為：終點乙醇質(zhì)量分數(shù)50%，藥液初始質(zhì)量濃度 1.15g/ml，攪拌速度500r/min，藥液pH5.0。該工藝操作簡便、效果穩(wěn)定，HSYA轉(zhuǎn)移率、浸出物得率和純度較高。

1.4 超聲提取法

孫燕雯等[7]通過單因素試驗選取試驗因素與水平，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，以HSYA為指標成分，以其提取率為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型并獲得最優(yōu)提取條件。實驗結(jié)果顯示最佳提取工藝為：超聲溫度 55℃，液料比 16∶1，超聲時間 39min，提取 3次。徐忠亮等[8]用超聲提取法，以HSYA百分含量為指標，考查提取時間、提取次數(shù)、提取液用量、提取溫度對HSYA純化的影響。結(jié)果顯示HSYA的最佳提取工藝為：加水8倍量，提取溫度為30℃，提取次數(shù)為3次，時間為1h/次。通過6次驗證試驗HSYA含量平均值為16.157mg/g，該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

1.5 閃式提取法

王玥等[9]以提取液中HSYA的含量為指標，采用正交試驗設(shè)計，對閃式提取的影響因素進行考察，并在提取率、提取時間、耗電量等方面與文獻報道的方法進行比較。結(jié)果顯示最佳提取工藝是以40倍水為溶劑，閃式提取2 min，100V電壓。何惠芳等[10]應(yīng)用單因素試驗及正交實驗優(yōu)化閃式提取法提取HSYA的最佳工藝條件，包括最佳溶劑倍數(shù)、提取時間、提取電壓，并與溫浸提取法進行比較。結(jié)果顯示閃式提取最佳工藝為40倍水，閃式提取2.5min，90V電壓。

1.6 大孔樹脂純化法

唐紅等[11]考察了HPD200A大孔樹脂對羥基紅花黃色素A分離的最佳條件。用溫浸法提取，選用ZTCl+1澄清劑進行初步除雜，采取靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附方法篩選HPD200A型大孔樹脂最佳條件。運用紫外-可見分光光度法測定紅花液中羥基紅花黃色素A的含量，薄層色譜定性分析。顯示最佳洗脫劑濃度為濃度50%乙醇，上樣液pH為5，洗脫流速為1ml/min，徑高比為 l∶7，柱體積為2%。 李云云[5]為提高紅花黃色素中HSYA的含量，通過大孔吸附樹脂對HSYA的吸附量、解吸率和靜態(tài)吸附的動力學(xué)研究，考察了9種大孔吸附樹脂的吸附性能。實驗結(jié)果表明，HPD200A型號的樹脂對HSYA的吸附量和解吸率都比較高，并且對大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)的研究進一步說明分離純化HSYA適宜的樹脂是HPD200A。

1.7 其他方法

李勵珺等[12]使用有機溶劑二甲基亞砜（DMSO）提取HSYA。采用HPLC法，以HSYA含量為指標，采用正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝，考察沉淀試劑及用量，并考察不同除雜方式的效果。其最佳制備工藝為：14倍量DMSO常溫避光攪拌30min除雜，抽濾；濾渣加入14倍量DMSO浸泡1h，在 80℃下，密閉熱提 50min，抽濾，濾渣加入 12倍量DMSO，在 80℃下，密閉熱提50min，抽濾，合并濾液；濾液加入3倍量乙酸丁酯，離心，沉淀用適量乙醇洗滌，干燥，最終沉淀物純度為14.56%。 本實驗首次以非水溶媒為提取溶劑制備HSYA，該工藝具有操作簡單、經(jīng)濟、環(huán)保等優(yōu)點。李頁瑞等[13]用罐組式逆流提取技術(shù)提取HSYA。楊艷紅等[14]采用微波萃取法提取HSYA。

2 HSYA的含量測定方法

2.1 HPLC法

因具有操作簡便、快速、準確可靠、重現(xiàn)性好和專屬性強等特點，HPLC法已廣泛應(yīng)用于HSYA的含量測定。譚生建等[15]在測定強筋健骨散中羥基紅花黃色素A的含量是使用了HPLC測定方法。楊輝等[16]對HSYA進行提取工藝改進時采用HPLC法測定其含量。王秀梅等[17]使用HPLC法建立紅花地上部分中HSYA和木犀草素的含量測定方法。李江然等[18]采用HPLC法測定大鼠口服HSYA后糞便和尿液中含量。艾散江等[19]建立了HPLC法測定藥食同源紅花中HSYA含量的方法。張朝陽等[20]建立HPLC法測定大鼠口服紅花水提物和紅花黃色素后尿、糞和膽汁中HSYA的含量。具體檢測條件和回收率見表1。

2.2 紫外分光光度法

梁穎等[21]對天然色素紅花黃色素中HSYA的含量進行檢測時，采用了紫外分光光度法。波長403nm下線性范圍為 0.0176～0.0704mg/ml。

2.3 近紅外光譜（NIRS）透射法

與傳統(tǒng)分析方法相比，近紅外光譜特性穩(wěn)定，具有快速分析、無需消耗試劑等特點，是一種快速無損的綠色分析技術(shù)。陳雪英等[22]采用NIRS透射法對紅花罐組式逆流提取過程中HSYA的含量進行快速無損的測定。校正模型相關(guān)系數(shù)達到0.982，預(yù)測相關(guān)系數(shù)達到0.965，校正集預(yù)測誤差均方根 （RMSEC）和驗證集預(yù)測誤差均方根（RMSEP）分別為 0.053和 0.075，校正集相對偏差（RSEC）和驗證集相對偏差（RSEP）分別為3.96%和5.25%。結(jié)果表明，NIRS可以作為一種準確、快速、無損的檢測方法用于檢測中藥逆流提取過程有效成分含量變化規(guī)律。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法

相比HPLC，LC-MS法具有更高的檢測靈敏度和更小的雜質(zhì)信號干擾，常用于藥代動力學(xué)研究中樣品的批量分析。李長印等[23]采用LC-MS/MS法測定人血漿中HSYA的濃度，采用 Agilent ZORBAX SB C18 （3.0mm×100mm，3.5μm）色譜柱進行等度洗脫分離，流動相為0.2mmol/L乙酸銨水溶液∶甲醇=30∶70。質(zhì)譜檢測采用負離子模式，掃描方式為多反應(yīng)檢測，結(jié)果顯示血漿中HSYA的線性范圍為8.57～4185μg/L（r為 0.9949～0.9992），定量下限 8.570μg/L，日內(nèi)日間精密度RSD均＜7%；低、中、高3個濃度下的平均介質(zhì)效應(yīng)分別為116.62%、119.06%和 115.72%，（RSD分別為3.27%、3.42%和4.93%），平均提取回收率分別為77.75%、80.90%和 80.76%，（RSD 分別為 1.70%、1.78%和4.15%）。

HSYA的水溶性好，但是對熱不穩(wěn)定，在提取分離過程中盡量不要長時間高溫處理，避免分解破壞[24]，分離得到的HSYA要及時置冷藏室保存。

表1 用于HSYA分析和定量的HPLC法

[1]鄭虎占，董澤宏，佘靖，等.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用[M].北京：學(xué)苑出版社，1998.2057.

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