李瑞霞　霍艷麗　李洪杰　王惟帥　張愛平　楊正禮

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所， 北京 100081； 2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)旅游學(xué)院， 石家莊 050061；3.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 張家口 075000； 4.德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 德州 253015)

0　引言

氮素是作物生長發(fā)育的主要限制因子，但土壤中過量氮素的存在既會影響氮肥增產(chǎn)效用的發(fā)揮、增加氮素的損失，又易引起環(huán)境污染[1]。研究表明，施氮量的50%通過揮發(fā)、淋溶、徑流和反硝化作用進入環(huán)境[2]，造成水體富營養(yǎng)化、溫室氣體排放、土壤退化等嚴重的環(huán)境問題[3]。華北平原是我國的典型農(nóng)區(qū)，氮肥施用過量問題突出。為了解決作物高產(chǎn)與氮肥大量施用引起的環(huán)境污染這一矛盾，如何基于作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，提高氮肥利用效率已是亟待解決的問題。

CHEN等[4]通過對我國三大糧食作物主產(chǎn)區(qū)實施的153個田間試驗研究表明，在化肥用量不變情況下，我國水稻、小麥、玉米至少還有30%～50%的增產(chǎn)潛力。近年來大量田間試驗也證實，適量減氮有助于作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)[5-8]。PENG等[5]研究表明，與農(nóng)民習(xí)慣施肥相比，在植物營養(yǎng)生長階段減施氮肥總用量的30%不僅不會降低產(chǎn)量，反而略有增產(chǎn)，并使氮肥農(nóng)學(xué)利用率翻倍。易瓊等[6]在長江中下游平原研究發(fā)現(xiàn)，與當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥相比，減氮20%～30%時小麥產(chǎn)量沒有降低。李錄久等[7]在巢湖流域水稻產(chǎn)區(qū)，在施氮量180 kg/hm2基礎(chǔ)上，適當(dāng)減少氮肥施用量對水稻產(chǎn)量影響不大。董強等[8]研究表明，3種減量施氮模式較傳統(tǒng)施氮模式施氮量減少20%的情況下，玉米產(chǎn)量連續(xù)3年無顯著變化。因此，確定適宜的減氮量有利于發(fā)揮作物增產(chǎn)潛力，提高氮肥利用效率，同時降低環(huán)境成本，是我國農(nóng)業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)，也是改善全球氮平衡的一項重要舉措[9]。

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物寄主中并度過全部或近乎全部生活周期，而對寄主植物并不引起明顯病害的真菌[10]。植物內(nèi)生真菌作為一種新型的微生物資源，具有提高宿主抗逆能力(干旱、病蟲害和重金屬等)以及促進宿主對氮、磷等元素的吸收和利用[11-13]。由于根系與土壤接觸，其定殖的內(nèi)生真菌主要來自土壤微生物的侵染。研究表明，氮肥水平能顯著影響土壤真菌的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)組成[14]，特別是能改變叢枝菌根的菌群結(jié)構(gòu)[15]。由于叢枝菌根真菌能夠增加植物-真菌之間的交互作用，可在減少外源施肥的情況下，促進植物生長[16]，為減量施氮提供了可能。

玉米節(jié)根分為地上節(jié)根(氣生根)和地下節(jié)根(次生根)，由于其分枝多、根毛密、根量大、功能期長，是玉米的主要根系[17]，在抗倒伏、水分和營養(yǎng)物質(zhì)吸收中起著重要作用[18]。灌漿期是玉米產(chǎn)量形成的重要時期，受到研究者的普遍重視。目前，關(guān)于灌漿期夏玉米節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性以及不同節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性對產(chǎn)量的影響機制尚未見報道。因此，本研究基于田間定位試驗，研究氮肥減量對夏玉米節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性的影響，旨在揭示地上和地下節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性對產(chǎn)量影響的機制，以期建立合理減氮措施，提高氮肥利用效率，為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1　試驗材料與方法

1.1　試驗設(shè)計

試驗地點位于山東省德州市平原縣黃河涯鎮(zhèn)德州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技園試驗基地。德州市平原縣屬暖溫帶半干旱地區(qū)，土壤類型為砂壤土，年平均降水量547.5 mm，主要集中在6—8月，年平均氣溫12.9℃，平均無霜期為206 d，年積溫4 639℃。試驗前耕層(0～20 cm)有機質(zhì)和堿解氮、有效磷、速效鉀質(zhì)量比分別為13.17 g/kg和26.56、34.27、106 mg/kg，pH值8.54。

在常規(guī)施肥270 kg/hm2的基礎(chǔ)上，設(shè)置3個氮肥減量處理，分別為：0%(CK：270 kg/hm2)、-10%(N1：243 kg/hm2)、-20%(N2：216 kg/hm2)和-30%(N3：189 kg/hm2)，采取隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，每個小區(qū)面積30 m2，小區(qū)間隔1 m，共計12個小區(qū)。種植制度為冬小麥-夏玉米輪作，供試作物為夏玉米，品種為魯寧184，采用機械播種，行距60 cm、株距20 cm。氮肥按照基肥和拔節(jié)期追肥6∶4的比例施入，磷(P2O5)和鉀(K2O)分別為45、60 kg/hm2，作底肥一次性施入。灌水、除草和噴藥等措施同常規(guī)田間管理。2016年6月27日播種，10月10日收獲。

1.2　根系取樣方法

夏玉米灌漿后期(2016年9月27日)，在每小區(qū)中間部位隨機選取植株生長均勻一致的5株玉米，割掉地上部位后在距玉米根10 cm處四周挖斷層面，然后沿每株主根方向垂直向下挖20 cm深完整根塊，根系樣品用清水洗凈，然后把莖生節(jié)根分為地下節(jié)根和地上節(jié)根兩類，將組織表面的水分用濾紙吸干，浸泡于1%次氯酸鈉溶液中50 s，無菌水沖洗3次，再浸泡于75%乙醇溶液1 min，用無菌水沖洗3次，進行表面消毒滅菌。濾紙吸干后，再剪成0.5 cm×0.5 cm的根段，置于無菌袋并保存于-80℃冰箱備用。根樣送至北京奧維森基因科技有限公司，進行基因DNA提取、PCR擴增、熒光定量，并應(yīng)用Illumina MiSeq平臺對內(nèi)生真菌基因ITS1進行測序。

1.3　高通量測序方法

高通量測序作為第二代測序技術(shù)，能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，有助于準(zhǔn)確分析環(huán)境中微生物群落組成和分布。本研究采用此技術(shù)，通過Illumina MiSeq 平臺進行Paired-end測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME(V1.8.0)軟件過濾、拼接、去除嵌合體，再調(diào)用uclust德爾方法[19]對優(yōu)質(zhì)序列按相似度大于等于97%進行OTU的聚類，選取每個類最長的序列為代表序列。然后調(diào)用RDP-classifier(Version 2.2，http:∥sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進行物種注釋分析，最終得到每個OTU分類學(xué)信息。對于不符合以上標(biāo)準(zhǔn)的 OTU 歸為“未分類真菌類群”。

利用 Mothur 軟件(Version 1.31.2)計算內(nèi)生真菌ɑ多樣性指數(shù)，其中Chao1豐富度指數(shù)計算公式為

式中Sobs——檢測到的所有OTU總數(shù)

N1——只有1條序列的OTU數(shù)目

N2——只有2條序列的OTU數(shù)目

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)計算公式為

SShannon-Wiener=-∑(ni/N)ln(ni/N)

式中ni——各分類單元中包含的序列數(shù)

N——所有數(shù)列之和

相似性系數(shù)采用Sorenson指數(shù)公式

Cs=2j/(a+b)

式中j——2個群落共有物種數(shù)

a、b——群落A、B的物種數(shù)

1.4　數(shù)據(jù)分析方法

采用 SPSS 16.0 (SPSS Inc.，Chicago, IL, Version 16.0)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，確定氮肥減量對夏玉米地上和地下節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性和豐度的影響，采用Duncan多重比較法，在0.05水平進行差異顯著性檢驗。采用Pearson系數(shù)分析地上和地下節(jié)根內(nèi)生真菌群落組成與產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素之間的相關(guān)性。

2　結(jié)果與分析

2.1　氮肥減量對夏玉米節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)的影響

由表1可知，地上和地下節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性對氮肥減量的響應(yīng)不同。群落豐富度Chao1 指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。在對照、N1和N3處理中地下節(jié)根豐富度大于地上節(jié)根，N2處理中地上節(jié)根豐富度大于地下節(jié)根。Shannon-Wiener指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。在對照和N3兩個處理中地下節(jié)根Shannon-Wiener指數(shù)大于地上節(jié)根，N1和N2兩處理中地上節(jié)根Shannon-Wiener指數(shù)大于地下節(jié)根。

在地上節(jié)根，氮肥減量對Chao1指數(shù)影響不顯著，其中N2處理Chao1指數(shù)最高，N3處理Chao1指數(shù)最低，N2和N3處理之間差異顯著；氮肥減量顯著增加Shannon-Wiener指數(shù)，其中N1、N2和N3處理分別增加36.75%、34.63%和12.37%。在地下節(jié)根，與對照相比，Chao1指數(shù)在N1處理中略有降低，但未達到顯著水平；N2和N3兩個處理分別顯著降低22.30%和28.02%，Shannon-Wiener指數(shù)顯示N1、N2和N3處理分別顯著降低14.02%、14.25%和20.79%(表1)。

表1　不同處理節(jié)根內(nèi)生真菌和土壤真菌多樣性指數(shù)Tab.1　Nodal root endophytic fungal and soil fungal diversity index in different treatments

注：數(shù)據(jù)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，a、b和c代表不同處理間的差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2　氮肥減量對夏玉米節(jié)根內(nèi)生真菌群落組成的影響

在門分布水平，除去未鑒定出來的真菌(undentified fungus)外，兩類節(jié)根內(nèi)生壺菌門(Chytridiomycota)只出現(xiàn)在CK、N1和N2處理。子囊菌門、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門和接合菌門(Zygomycota)4個門在所有處理中都有分布，其中子囊菌門為優(yōu)勢菌門，在地上節(jié)根內(nèi)相對豐度為54.15%～78.38%，在地下節(jié)根內(nèi)相對豐度為91.62%～99.10%。在地上節(jié)根內(nèi)，與對照相比，N1處理顯著顯著提高球囊菌門3443.16%，顯著降低子囊菌門豐度15.48%；N3處理顯著提高子囊菌門豐度13.39%(圖1a)。在地下節(jié)根內(nèi)，N1、N2和N3處理顯著提高子囊菌門豐度36.52%、38.60%和30.69%，顯著降低擔(dān)子菌門86.20%、77.87%和93.89%。N1和N3處理分別顯著提高球囊菌門豐度336.30%和893.06%，而N1和N2處理卻分別顯著降低接合菌門豐度79.02%和91.91%(圖1b)。

在子囊菌門常見目水平，與對照相比，N1、N2和N3處理顯著提高地上節(jié)根內(nèi)格孢菌目豐度，分別提高435.64%、213.89%和809.95%；其中N2處理顯著提高糞殼菌目豐度766.75%，N3處理顯著降低刺盾炱目豐度(Chaetothyriales)27.39%(圖1a)。與對照相比，N1、N2和N3處理顯著提高地下節(jié)根糞殼菌目139.16%、532.62%、1 319.22%和刺盾炱目豐度335.93%、553.47%、297.83%，顯著降低肉座菌目52.78%、15.13%、78.14%和炭角菌目豐度96.74%、98.50%、99.04%，其中N1處理還顯著提高格孢菌目豐度1239.23%(圖1b)。

圖1　不同處理節(jié)根內(nèi)生真菌門和目水平(子囊菌門的常見目)相對豐度Fig.1　Proportions of nodal root endophytic fungal phyla and common fungal orders (1%) within Ascomycota in different treatments

在OTU水平，由圖2a可知，所有處理在地上節(jié)根中總計發(fā)現(xiàn)379 OTU，各個處理中都有123個相同的OTU，占總OTU比例為32.45%。其中，CK、N1、N2和N3中分別有232、254、264和210 OTU，特有OTU分別有29、18、32和33。與對照相比，N1、N2和N3的相似系數(shù)分別為74.90%、69.35%和64.25%。由圖2b可知，所有處理在地下節(jié)根中總計發(fā)現(xiàn)427 OTU，各個處理中都有140個相同的OTU，占總OTU比例為32.79%。CK、N1、N2和N3中分別有394、268、247和257 OTU，獨有OTU分別為56、18、13和39。與對照相比，N1、N2和N3的相似系數(shù)分別為64.05%、57.72%和54.38%?？梢?，地上節(jié)根與對照的相似系數(shù)高于地下節(jié)根。

圖2　不同處理節(jié)根內(nèi)生真菌特有和共有OTU韋恩圖Fig.2　Venn diagrams of nodal root endophytic fungual showing specific and shared OTU of different treatments

2.3　氮肥減量對夏玉米產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

由表2可知，與對照處理相比，氮肥減量10%～30%對夏玉米百粒質(zhì)量、穗粒數(shù)和產(chǎn)量影響均不顯著。夏玉米有效穗數(shù)在氮肥減量10%處理有降低趨勢，反而在氮肥減量20%～30%兩個處理中有增加趨勢，均與對照處理差異不明顯。可見，在華北地區(qū)氮肥減量達30%時夏玉米產(chǎn)量無明顯變化。

表2　不同處理下夏玉米產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因素Tab.2　Summer maize yield and its components in different treatments

Pearson相關(guān)性分析表明(表3)，夏玉米百粒質(zhì)量和產(chǎn)量與兩類節(jié)根內(nèi)生真菌種群組成均不相關(guān)。穗粒數(shù)與地上節(jié)根內(nèi)格孢菌目豐度和地下節(jié)根內(nèi)球囊菌門豐度呈顯著正相關(guān)，與地下節(jié)根內(nèi)肉座菌目豐度呈顯著負相關(guān)。有效穗數(shù)與地下節(jié)根內(nèi)糞殼菌目豐度呈顯著正相關(guān)。

表3　節(jié)根內(nèi)生真菌群落組成與產(chǎn)量的Pearson相關(guān)系數(shù)Tab.3　Pearson’s correlation coefficient between nodal root fungi community composition and yield

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05) 。

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在夏玉米灌漿后期，氮肥減量10%～30%對地上節(jié)根內(nèi)生真菌Chao1指數(shù)影響不顯著，氮肥減量20%～30%時顯著降低地下節(jié)根內(nèi)生真菌豐富度Chao1指數(shù)；氮肥減量10%～30%顯著提高地上節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性Shannon-Wiener指數(shù)，卻顯著降低地下節(jié)根內(nèi)生真菌同類指數(shù)。以上結(jié)果說明，內(nèi)生真菌多樣性Shannon-Wiener指數(shù)較豐富度Chao1指數(shù)敏感，氮肥減量縮小了兩類節(jié)根之間的差距。這可能是由于玉米灌漿期的上層節(jié)根中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量高于下層節(jié)根[20]，有利于地上節(jié)根內(nèi)生真菌的侵染，導(dǎo)致地上節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性Shannon-Wiener指數(shù)提高。內(nèi)生真菌對感染植株的氮代謝和氮積累有顯著影響[21]，促進植株對氮素的吸收和高效利用。并有研究表明，在玉米生育后期，提高玉米的上層根系質(zhì)量，維持其較高、較長的活力是促使玉米獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵[22-23]?？梢?，氮肥減量提高夏玉米灌漿后期的地上節(jié)根內(nèi)生真菌多樣性，將有利于玉米獲得高產(chǎn)。

根部是內(nèi)生菌進入植物體內(nèi)的主要位點[24]，由于根系與土壤接觸，其定殖的內(nèi)生真菌主要來自土壤微生物的侵染。玉米整個生長期內(nèi)，根的內(nèi)生真菌定殖率呈上升趨勢[25]。在夏玉米灌漿后期，氮肥減量顯著提高地上節(jié)根內(nèi)格孢菌目豐度；顯著提高地下節(jié)根內(nèi)糞殼菌目和刺盾炱目豐度，卻顯著降低肉座菌目和炭角菌目豐度?？梢姡蕼p量并未顯著改變節(jié)根內(nèi)生真菌群落組成，但不同程度地改變了內(nèi)生真菌類群的豐度，特別是能改變叢枝菌根豐度。在減氮10%處理中地上和地下節(jié)根內(nèi)球囊菌門豐度以及減氮30%處理中地下節(jié)根內(nèi)球囊菌門豐度顯著高于對照。球囊菌門真菌提高節(jié)根的根系活力，促進玉米生長發(fā)育，有利于提高玉米產(chǎn)量[26]。因此，節(jié)根內(nèi)球囊菌門真菌豐度有可能作為氮肥合理減量的指示菌。隨著氮肥減量比例增加，節(jié)根內(nèi)生真菌群落與對照之間相似性系數(shù)逐漸降低，但總體相似性較高(大于0.50)。地上節(jié)根與對照的相似系數(shù)高于地下節(jié)根，這可能與根系組織內(nèi)生理條件、組織結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)等因素不同，從而影響內(nèi)生真菌的侵染過程，使內(nèi)生真菌的分布表現(xiàn)出組織偏好性或?qū)Ｒ恍訹27-28]。夏玉米灌漿后期地下節(jié)根開始老化，SUN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，較老的植物組織由于發(fā)生表皮降解等變化，有利于內(nèi)生真菌侵染過程的實現(xiàn)。相關(guān)性分析表明，地上節(jié)根內(nèi)格孢菌目和地下節(jié)根內(nèi)球囊菌門真菌有利于穗粒數(shù)形成，而地下節(jié)根內(nèi)肉座菌目真菌卻抑制穗粒數(shù)的形成。地下節(jié)根內(nèi)糞殼菌目真菌促進有效穗數(shù)的形成。

本試驗僅關(guān)注了氮肥減量條件下節(jié)根內(nèi)生真菌群落組成對產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響，而節(jié)根內(nèi)生真菌還有很多未分類或是未確定種屬的物種，它們也受到氮肥減量的影響，但其功能和特點尚不清楚，還有待通過深度測序或利用其他先進手段對微生物進行更細致的分類研究，并結(jié)合根系生長[29]和根際土壤相關(guān)指標(biāo)進行深入探索。適宜的氮肥減量是保障作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，維持土壤肥力和減少農(nóng)業(yè)面源污染的關(guān)鍵。近年來大量研究表明，在農(nóng)民習(xí)慣施氮水平下，減氮20%～30%對水稻、小麥和玉米產(chǎn)量影響不明顯，但均是短期結(jié)果。因此，尚需對田間定位試驗進行跟蹤研究，最終確定適宜的減氮比例。

4　結(jié)論

(1)夏玉米灌漿后期，在氮肥減量10%～20%時，提高了地上節(jié)根內(nèi)生真菌Chao1和Shannon-Wiener指數(shù)，氮肥減量10%～30%降低了地下節(jié)根內(nèi)生真菌的Chao1和Shannon-Wiener指數(shù)，其中減氮20%時地上節(jié)根內(nèi)Chao1和Shannon-Wiener指數(shù)高于地下節(jié)根內(nèi)兩指數(shù)。

(2)在門水平，氮肥減量10%時顯著提高地上節(jié)根內(nèi)球囊菌門和未分類菌門豐度，顯著降低子囊菌門豐度；氮肥減量20%時各菌門豐度變化不顯著；氮肥減量30%時顯著提高子囊菌門豐度，顯著降低未分類菌門豐度。氮肥減量10%～30%顯著提高地下節(jié)根內(nèi)子囊菌門豐度，顯著降低擔(dān)子菌門和未分類菌門豐度，其中氮肥減量10%和30%時顯著提高球囊菌門豐度，氮肥減量10%～20%時顯著降低接合菌門豐度，壺菌門真菌在減氮30%處理中消失。

(3)在子囊菌門常見目水平，氮肥減量10%～30%顯著提高地上節(jié)根內(nèi)格孢菌目豐度，其中減氮20%處理顯著提高糞殼菌目豐度，顯著降低刺盾炱目豐度。氮肥減量10%～30%顯著提高地下節(jié)根內(nèi)糞殼菌目和刺盾炱目豐度，顯著降低肉座菌目和炭角菌目豐度，其中減氮10%時還顯著提高格孢菌目豐度。在OTU水平，氮肥減量10%～20%提高了地上節(jié)根內(nèi)OTU數(shù)目，減量10%～30%時降低了地下節(jié)根內(nèi)OTU數(shù)目。與對照相比，相似系數(shù)隨著氮肥減量比例的增加而逐漸降低。

(4)氮肥減量10%～30%對夏玉米產(chǎn)量、百粒質(zhì)量、穗粒數(shù)和有效穗數(shù)影響均不明顯。相關(guān)性分析表明，地上節(jié)根內(nèi)格孢菌目真菌和地下節(jié)根內(nèi)球囊菌門真菌、肉座菌目真菌是影響穗粒數(shù)的主要因素。地下節(jié)根內(nèi)糞殼菌目真菌是影響有效穗數(shù)的主要因素。經(jīng)綜合比較，減氮30%處理的效果優(yōu)于其他處理，與對照相比，在灌漿后期可顯著提高地上節(jié)根子囊菌門和格孢菌目豐度而顯著降低未分類菌門豐度，壺菌門真菌消失；顯著提高地下節(jié)根內(nèi)子囊菌門、球囊菌門、糞殼菌目和刺盾炱目豐度而顯著降低擔(dān)子菌門、未分類菌門、肉座菌目和炭角菌目豐度，壺菌門真菌消失。

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