殼寡糖酶法糖基化修飾對玉米醇溶蛋白功能性質(zhì)的影響

王曉杰，劉曉蘭，叢萬鎖，鄭喜群，許英一，石彥國*

玉米蛋白粉中約含62%～71%的蛋白質(zhì)，是濕法玉米淀粉加工中產(chǎn)量最大、蛋白質(zhì)含量最高的副產(chǎn)物。玉米蛋白的主要組分是玉米醇溶蛋白（65%～68%）和谷蛋白（22%～33%）[1]。玉米醇溶蛋白的主要氨基酸組成是亮氨酸（約占20%）、谷氨酸（包含谷氨酸鈉）（約占21%～26%）、脯氨酸（約占10%）和丙氨酸（約占10%）[2]，其二級結(jié)構(gòu)以螺旋型結(jié)構(gòu)為主[3]。玉米醇溶蛋白的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致其水溶性差、疏水性較強(qiáng)，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。另外，在玉米醇溶蛋白的多肽鏈中存在多種生物活性的功能區(qū)，如抗氧化、抗高血壓、促進(jìn)乙醇代謝等多肽功能序列[4-6]，也因其水溶性差而不能表現(xiàn)出來。所以，要使玉米醇溶蛋白的生理功能和加工特性都能表現(xiàn)出來，必須要改善其水溶性。

目前，食品蛋白質(zhì)的改性主要是采用美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)是指還原糖與氨基酸、蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜反應(yīng)。美拉德反應(yīng)能夠顯著改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、泡沫性、凝膠性以及抗氧化活性[7-11]。然而，美拉德反應(yīng)難以控制糖基化度，還會導(dǎo)致產(chǎn)生致突變物而存在安全隱患，所以需要研究一種更安全、更有效的方法來替代美拉德反應(yīng)進(jìn)行食品蛋白質(zhì)的糖基化修飾。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase，EC 2,3,2,13）屬于?；D(zhuǎn)移酶，能催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-甲酰胺（供體）和不同化合物的ε-氨基（受體）之間異肽鍵的形成[12]。如果受體由含有賴氨酸殘基的蛋白質(zhì)提供，則發(fā)生蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)反應(yīng)；如果受體由含有伯胺基團(tuán)的糖提供，則發(fā)生糖與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合反應(yīng)，即發(fā)生蛋白質(zhì)的酶法糖基化修飾。已有研究表明，TGase催化的蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性、流變學(xué)性質(zhì)等功能性質(zhì)[13-15]，并且其反應(yīng)條件比美拉德糖基化更溫和，不存在美拉德反應(yīng)中所存在的副反應(yīng)。

玉米蛋白含有高比例的酰胺基氨基酸，且賴氨酸殘基含量少，因此，在含有伯胺基團(tuán)的糖的反應(yīng)體系中，TGase催化的糖基化反應(yīng)主要發(fā)生在玉米蛋白與供糖體之間，而發(fā)生在蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)反應(yīng)幾率低，因此，玉米蛋白是酶法糖基化修飾的良好底物。目前為止，鮮見殼寡糖酶法糖基化修飾玉米醇溶蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報道。在本課題組的前期工作中，已經(jīng)確定了TGase催化殼寡糖與玉米醇溶蛋白分子共價結(jié)合的糖基化反應(yīng)條件[16]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上，研究糖基化反應(yīng)對玉米醇溶蛋白功能性質(zhì)的影響，為糖基化修飾玉米醇溶蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉由中糧生化能源（龍江）有限公司提供，外觀呈金黃色顆粒狀。

微生物TGase（酶活力1 000 U/g） 泰興市一鳴生物制品有限公司；殼寡糖（脫乙酰度90%，平均分子質(zhì)量1 500 Da） 山東博智匯力生物科技有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid，ANS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2-脫氧-D-核糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PC/PLCLD-53真空冷凍干燥機(jī) 美國Millrock公司；TDL-5-A離心機(jī)、DL-1集熱式磁力加熱攪拌器上海安亭科學(xué)儀器廠；pB-10 pH計 北京賽多利斯儀器有限公司； IKA T25高剪切分散乳化機(jī) 德國IKA集團(tuán)；RF-530熒光分光光度計 日本島津公司；Zetasizer Nano ZS90電位分析儀 英國Malvern公司；Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白的糖基化修飾

向3%的玉米醇溶蛋白懸浮液中添加殼寡糖，保證反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)?；w與殼寡糖酰基受體的物質(zhì)的量比為1∶3（玉米醇溶蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為5∶4.026），用濃度為2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.7，按60 U/g蛋白的加酶量加入TGase，反應(yīng)混合物充分混勻后，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，置于85 ℃水浴鍋中滅酶5 min，冷卻至室溫。4 ℃透析除去反應(yīng)體系中未反應(yīng)的殼寡糖，樣品冷凍干燥后即為糖基化玉米醇溶蛋白。在上述反應(yīng)體系中，不加殼寡糖時制備交聯(lián)玉米醇溶蛋白。在此條件下，玉米醇溶蛋白糖基化的反應(yīng)得率為（69.97±0.39）%，交聯(lián)玉米醇溶蛋白的反應(yīng)得率為（5.15±0.98）%。在進(jìn)行物化性質(zhì)和抗氧化活性測定時，采用離心的方法將發(fā)生糖基化或交聯(lián)的玉米醇溶蛋白與未反應(yīng)完全的玉米醇溶蛋白分離。

1.3.2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物表面疏水性的測定

參照Kato等[17]的方法，略有改動。稱取玉米醇溶蛋白和糖基化修飾產(chǎn)物樣品各0.3 g，分別加入30 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS，pH 7.0），放在室溫條件下進(jìn)行溶解。24 h后蛋白質(zhì)樣品在10 000 r/min離心10 min，用Folin-酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，然后用0.01 mol/L的PBS（pH 7.0）稀釋該上清液得到系列質(zhì)量濃度（0.01～0.2 mg/mL）的蛋白質(zhì)溶液。取蛋白質(zhì)溶液4 mL，加入20 μL ANS（8 mmol/L，用pH 7.0的0.01 mol/L PBS配制），旋渦混勻，在室溫條件避光反應(yīng)15 min。在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm以及狹縫5 nm的條件下，測定ANS結(jié)合物的相對應(yīng)熒光強(qiáng)度，以相對熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，以線性關(guān)系良好的回歸曲線的斜率表示表面疏水性。

1.3.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

采用濁度法，測定方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.3.4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

采用攪打法，測定方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.3.5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物持水性的測定

取10 mL離心管，準(zhǔn)確稱取0.1 g玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物（以蛋白基計），分別加入5 mL蒸餾水，攪拌使蛋白質(zhì)樣品與水充分混合。在室溫放置30 min后，10 000 r/min離心30 min，倒出上清液，稱沉淀質(zhì)量m2，采用Folin-酚法測上清液蛋白質(zhì)含量m1。樣品持水性的計算公式如下：

式中：m0為加入蛋白質(zhì)干質(zhì)量/g；m1為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m2為離心后沉淀質(zhì)量/g。

1.3.6 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物吸油性的測定取10 mL離心管，準(zhǔn)確稱取0.1 g玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物（以蛋白基計），分別加入5 mL大豆色拉油，混勻，室溫放置30 min后10 000 r/min離心30 min，移除上清液中的油，測量油的體積，蛋白質(zhì)的吸油率用每克蛋白質(zhì)吸收油的體積表示。樣品吸油率的計算公式如下：

式中：V1為大豆色拉油總體積/mL；V0為未被吸附的大豆色拉油體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.7 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的紅外光譜分析

將蛋白樣品進(jìn)行壓片制樣，用傅里葉紅外光譜儀測定波數(shù)為4 000～400 cm－1的紅外光譜，分辨率4 cm－1，波數(shù)精度0.01 cm－1，掃描次數(shù)32 次，環(huán)境溫度25 ℃。利用Omnic V8.0軟件對譜圖進(jìn)行處理。

1.3.8 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物抗氧化活性的測定

抗氧化活性測定指標(biāo)包括DPPH自由基清除活性、超氧陰離子自由基清除活性、羥自由基清除活性、還原力和亞鐵離子螯合能力，測定方法參照文獻(xiàn)[19]。

1.3.9 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物游離氨基含量的測定

采用OPA法[20]，利用L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中游離氨基的含量，結(jié)果以mol/kg蛋白質(zhì)表示。

1.3.10 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物Zeta電位的測定

將待測樣品放入Zeta電位分析儀中，設(shè)定測量時間為2 min，溶劑的保留指數(shù)為1.326，溫度為25 ℃的條件下進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以 ±s表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，P小于0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的物化性質(zhì)

2.1.1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的表面疏水性

疏水性在蛋白質(zhì)構(gòu)象及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等方面具有重要的作用，并且被認(rèn)為與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)。以玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白為雙對照，對糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的表面疏水性Fig. 1 Surface hydrophobicity of zein and its modified products

由圖1可以看出，與玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白相比，糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性顯著降低。殼寡糖分子中含有較多的羥基，所以糖基的導(dǎo)入會降低玉米醇溶蛋白的表面疏水性。交聯(lián)反應(yīng)使表面疏水性顯著增加的可能原因是TGase的作用導(dǎo)致了玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)伸展，使包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露出來，因而交聯(lián)玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加，這與Jiang Shujuan[13]和Song Chunli[14]等的報道結(jié)果相一致。

2.1.2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的乳化能力包括乳化性和乳化穩(wěn)定性兩個指標(biāo)。乳化性指每克蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)變前所能乳化油的體積，而乳化穩(wěn)定性指蛋白質(zhì)維持穩(wěn)定的分散體系而不被外界破壞的能力[21]。分別測定玉米醇溶蛋白、交聯(lián)玉米醇溶蛋白和糖基化玉米醇溶蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig. 2 Emulsifying capacity and emulsion stability of zein and its modified products

由圖2可以看出，玉米醇溶蛋白的乳化性最高，而糖基化玉米醇溶蛋白的乳化性最低。3 種樣品的乳化穩(wěn)定性之間無顯著性差異（P＞0.05）。蛋白質(zhì)的乳化性與其溶解性及表面疏水性等因素有關(guān)，糖基化修飾后，玉米醇溶蛋白的表面疏水性降低，表面吸附能力下降，不能阻止油滴的聚結(jié)，同時整個體系的穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致乳化能力降低[20]。交聯(lián)玉米醇溶蛋白的乳化能力也降低，可能的原因是交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生了高分子聚合物，導(dǎo)致交聯(lián)玉米醇溶蛋白的溶解性降低，進(jìn)而使其乳化性降低。這與TGase催化蕓豆分離蛋白的交聯(lián)反應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)的乳化性的結(jié)果相一致[22]。

2.1.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的持水性和吸油性

持水性指在加工過程中，對蛋白質(zhì)中的水分以及添加到制品中參與加工的水分的保持能力；吸油性指蛋白質(zhì)產(chǎn)品吸附油的能力[23]。以玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白為雙對照，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度相同的條件下測定糖基化修飾對玉米醇溶蛋白持水功能和吸油性的改善程度，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，玉米醇溶蛋白的持水性最高，其次是交聯(lián)玉米醇溶蛋白，糖基化玉米醇溶蛋白的持水性最低。蛋白質(zhì)具有良好持水性需要具備3 個條件：1）蛋白質(zhì)復(fù)水后是否能充分溶脹但不溶解；2）蛋白質(zhì)顆粒復(fù)水后具有很高的黏度；3）蛋白質(zhì)可以形成凝膠網(wǎng)絡(luò)[24]。玉米醇溶蛋白經(jīng)糖基化修飾后表面疏水性下降、溶解性增加，在水溶液中呈現(xiàn)溶解狀態(tài)而非溶脹狀態(tài)，故持水性降低。玉米醇溶蛋白本身雖然疏水性強(qiáng)，但因其球狀體顆粒間存在間隙，測定時會有一部分水阻留在間隙內(nèi)，使得其持水性較高。

圖3 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的持水性和吸油性Fig. 3 Water-binding and oil-binding capacities of zein and its modified products

從圖3還可以看出，原玉米醇溶蛋白的吸油性最大，而糖基化玉米醇溶蛋白的吸油性最低?？赡艿脑蚴翘腔揎椄纳屏擞衩状既艿鞍椎娜芙庑裕褂团c玉米醇溶蛋白之間的疏水作用減弱，所以其吸油性降低。玉米醇溶蛋白與交聯(lián)玉米醇溶蛋白的吸油性間沒有顯著差異。TGase處理的大豆蛋白的持油性增加，與本研究結(jié)果不一致。分析可能的原因是，TGase處理的大豆蛋白同時發(fā)生了分子間和分子內(nèi)的交聯(lián)反應(yīng)，大豆蛋白溶解性改善的同時也生成了一些大分子物質(zhì)，這些大分子物質(zhì)具有吸油性[13]。而在本實(shí)驗(yàn)中，糖基化反應(yīng)只發(fā)生在玉米醇溶蛋白和殼寡糖之間，沒有或僅有少量的分子內(nèi)交聯(lián)產(chǎn)生的大分子物質(zhì)，溶解性改善的更好，導(dǎo)致吸油性下降。

2.1.4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)起泡性體現(xiàn)了蛋白質(zhì)液相體系形成穩(wěn)定的包裹小氣體的黏層能力。采用攪打法測定玉米醇溶蛋白、交聯(lián)玉米醇溶蛋白、糖基化玉米醇溶蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。

圖4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性Fig. 4 Foaming ability and foam stability of zein and its modified products

由圖4可以看出，玉米醇溶蛋白本身沒有起泡能力，交聯(lián)玉米醇溶蛋白的起泡性最高，為42.60%，糖基化玉米醇溶蛋白的起泡性為28.16%。3 種蛋白樣品溶液在攪打后形成的細(xì)小泡沫會迅速形成大的泡沫而破裂，導(dǎo)致3 種醇溶蛋白樣品均不具有泡沫穩(wěn)定性。交聯(lián)玉米醇溶蛋白起泡性能的提高可能是因?yàn)門Gase的作用導(dǎo)致玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)伸展，在攪拌時產(chǎn)生大的界面面積進(jìn)而增強(qiáng)起泡的能力。而糖基化玉米醇溶蛋白起泡性能的增強(qiáng)是由于糖基導(dǎo)入玉米醇溶蛋白分子中使蛋白溶解性增強(qiáng)的同時，提高了體系的黏度，當(dāng)受到急速機(jī)械攪拌時，大量氣體混入形成氣液界面，溶液中的蛋白質(zhì)快速吸附至氣液界面，表面張力降低，起泡性能增強(qiáng)。

2.2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的紅外光譜分析

圖5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig. 5 FT-IR spectra of zein and its modified products

從圖5可以看出，與玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白相比，糖基化玉米醇溶蛋白在波數(shù)1 140～1 023 cm－1范圍內(nèi)明顯不同，而在此范圍內(nèi)，玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白基本沒有差異，說明交聯(lián)沒有顯著影響玉米醇溶蛋白基團(tuán)的振動。波數(shù)1 080～1 025 cm－1處的峰是環(huán)狀COH，COC和CH2OH的C—O伸縮振動區(qū)（ν（C—O））[25]。波數(shù)1 050～1 150 cm－1處的峰是ν（C—O）和—OH的變形振動區(qū)[15]。糖基化玉米醇溶蛋白在1 075.74 cm－1處的伸縮振動顯著增強(qiáng)，說明糖基化玉米醇溶蛋白含有更多的C—OH，也進(jìn)一步說明在TGase的催化下，殼寡糖與玉米醇溶蛋白之間發(fā)生了共價結(jié)合，而與玉米醇溶蛋白共價結(jié)合的殼寡糖使玉米醇溶蛋白的水溶性增強(qiáng)，疏水性性能下降，與2.1.1節(jié)部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的抗氧化活性

2.3.1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性

由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，3 種蛋白樣品對DPPH自由基的清除能力均呈逐漸增加的變化趨勢。在相同質(zhì)量濃度下，殼寡糖糖基化修飾玉米醇溶蛋白的DPPH自由基清除率均高于玉米醇溶蛋白，而玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白的DPPH自由基清除能力無顯著差異。通過EC50值的計算，玉米醇溶蛋白的EC50值為1.776 mg/mL，交聯(lián)玉米醇溶蛋白的EC50值為2.317 mg/mL，糖基化玉米醇溶蛋白的EC50值為0.945 mg/mL。

圖6 不同質(zhì)量濃度條件下玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的DPPH自由基清除率Fig. 6 DPPH radical scavenging capacities of zein and its modified products at different concentrations

DPPH是一種以氮為中心很穩(wěn)定的自由基，如果受試物能清除DPPH自由基，則說明受試物具有供氫或接受電子的能力[16]。通過上述結(jié)果可知，與玉米醇溶蛋白相比，糖基化玉米醇溶蛋白的DPPH自由基清除率顯著增高，可能是由于糖基化產(chǎn)物中的殼寡糖可以提供更多的氫原子與DPPH自由基反應(yīng)，以形成穩(wěn)定的DPPH-H分子，使DPPH自由基被清除。

2.3.2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的還原力

圖7 不同質(zhì)量濃度條件下玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的還原力Fig. 7 Reducing power of zein and its modified products at different concentrations

由圖7可以看出，3 種玉米醇溶蛋白樣品的還原力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。在相同的質(zhì)量濃度下，殼寡糖糖基化修飾玉米醇溶蛋白的還原力均顯著高于玉米醇溶蛋白，而玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白的還原能力無顯著差異。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，糖基化玉米醇溶蛋白的還原力為0.448，比玉米醇溶蛋白高0.294，可能是因?yàn)樘堑鞍咨系奶腔峁╇娮咏o鐵離子，將其還原成亞鐵離子形式，使A700nm升高，糖基化樣品的還原力增強(qiáng)，即糖基化修飾改善了玉米醇溶蛋白的還原力。

2.3.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力

由圖8可知，玉米醇溶蛋白本身不具有螯合亞鐵離子的能力，經(jīng)殼寡糖糖基化修飾后玉米醇溶蛋白的亞鐵離子螯合率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，亞鐵離子螯合率最大，達(dá)46.27%。而交聯(lián)玉米醇溶蛋白僅在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時才表現(xiàn)出螯合亞鐵離子的能力。殼寡糖糖基化修飾改善了玉米醇溶蛋白對亞鐵離子的螯合能力，可能是由于玉米醇溶蛋白分子上共價結(jié)合的殼寡糖分子中存在的氨基含有孤對電子，可以形成殼寡糖-亞鐵離子復(fù)合物，因此具有較強(qiáng)的離子絡(luò)合能力[26]。亞鐵離子可以與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥基，而羥基是反應(yīng)活性很強(qiáng)的自由基，因此抗氧化劑具有高的亞鐵離子螯合能力，就可以阻止羥基的產(chǎn)生，因而具有抗氧化的活性。

圖8 不同質(zhì)量濃度下玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的亞鐵離子螯合率Fig. 8 Ferrous ion-chelating activities of zein and its modified products at different concentrations

2.3.4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的羥自由基清除能力

圖9 不同質(zhì)量濃度條件下玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的羥自由基清除率Fig. 9 Hydroxyl radical scavenging capacities of zein and its modified products at different concentrations

由圖9可知，玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的羥自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)出遞增的變化趨勢。在相同的質(zhì)量濃度條件下，糖基化玉米醇溶蛋白的羥自由基清除率均顯著高于玉米醇溶蛋白，而交聯(lián)玉米醇溶蛋白對羥自由基的清除能力略低于原玉米醇溶蛋白。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，糖基化玉米醇溶蛋白的羥自由基清除率為19.39%，比玉米醇溶蛋白高9.47%。說明經(jīng)過糖基化修飾改善了玉米醇溶蛋白對羥自由基的清除活性，可能是由于玉米醇溶蛋白和殼寡糖共價結(jié)合后，不僅供氫能力增強(qiáng)，而且其亞鐵離子螯合能力也增強(qiáng)，亞鐵離子與H2O2間的Fenton反應(yīng)就有可能被束縛，減少了羥自由基的產(chǎn)生，最終達(dá)到阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的目的[27]。

2.3.5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除能力

圖10 不同質(zhì)量濃度條件下玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除率Fig. 10 Superoxide radical scavenging capacities of zein and its modified products at different concentrations

由圖10可知，玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物均具有超氧陰離子自由基的清除能力，且清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加均呈遞增的變化趨勢。在每一個相同的質(zhì)量濃度下，糖基化玉米醇溶蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力均高于玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，殼寡糖修飾玉米醇溶蛋白的超氧陰離子自由基清除率為17.01%，比玉米醇溶蛋白高6.29%，可能是因?yàn)橛衩状既艿鞍追肿由瞎矁r結(jié)合的殼寡糖分子中的氨基能在溶液中結(jié)合一個氫離子而形成NH3＋，NH3＋中的氫離子可與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的物質(zhì)，從而起到清除自由基的作用[22]。

綜上所述，糖基化修飾改善了玉米醇溶蛋白的抗氧化活性，可能是由于玉米醇溶蛋白分子上共價結(jié)合的殼寡糖部分通過提供更多的氫原子與游離自由基反應(yīng)阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和/或通過螯合金屬離子如亞鐵離子等使自由基失活或處于不溶性狀態(tài)。而交聯(lián)玉米醇溶蛋白與原玉米醇溶蛋白的抗氧化活性之間沒有顯著差異，這是因?yàn)橛衩状既艿鞍字泄劝滨０返摩?甲酰胺與賴氨酸的ε-氨基之間的交聯(lián)反應(yīng)很少發(fā)生導(dǎo)致的，因?yàn)橛衩状既艿鞍追肿又腥鄙儋嚢彼帷?/p>

2.4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的游離氨基含量和Zeta電位

為了證實(shí)糖基化樣品的亞鐵離子螯合能力和自由基清除能力與殼寡糖分子上的游離氨基有關(guān)，分別測定玉米醇溶蛋白和經(jīng)過糖基化處理后樣品的游離氨基含量和Zeta電位，結(jié)果如表1所示。

表1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的游離氨基含量和Zeta電位的變化Table 1 Free amino group contents and Zeta potentials of zein and its modified products

由表1可以看出，糖基化玉米醇溶蛋白的游離氨基含量顯著高于玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白，說明殼寡糖的共價結(jié)合使玉米醇溶蛋白具有較高的游離氨基含量，也證實(shí)了糖基化玉米醇溶蛋白抗氧化活性的改善與游離氨基有關(guān)。交聯(lián)玉米醇溶蛋白的游離氨基含量略低于玉米醇溶蛋白，主要是由于玉米醇溶蛋白的賴氨酸中的ε-氨基參與了蛋白質(zhì)的自交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致，但兩者在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異，說明與糖基化反應(yīng)相比，蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生幾率較低。

由表1還可以看出，玉米醇溶蛋白的Zeta電位為－43.5 mV，說明玉米醇溶蛋白表面帶負(fù)電荷。通過糖基化修飾后，糖基化玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白Zeta電位的絕對值均顯著變小，可能是由于長鏈殼寡糖的共價結(jié)合或交聯(lián)反應(yīng)生成的大分子物質(zhì)屏蔽了玉米醇溶蛋白表面的部分電荷而導(dǎo)致的[28]。另外，Zeta電位的絕對值越大，粒子間的靜電排斥力較大，就不易發(fā)生聚沉，則溶液的穩(wěn)定性越強(qiáng)，反之則溶液的穩(wěn)定性越差[29-30]。殼寡糖的共價結(jié)合使玉米醇溶蛋白的Zeta電位的絕對值變小，即整個體系趨于不穩(wěn)定，增加了糖基化玉米醇溶蛋白提供電子和與自由基結(jié)合的能力，最終表現(xiàn)為糖基化玉米醇溶蛋白清除自由基的能力得到增強(qiáng)，同時乳化能力下降。

3 結(jié) 論

由于玉米醇溶蛋白不溶于水且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以玉米醇溶蛋白為原料，利用TGase催化的糖基化反應(yīng)對玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性，以期利用殼寡糖的溶解性改善玉米醇溶蛋白的功能性質(zhì)。紅外光譜和游離氨基含量的測定結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化下，玉米醇溶蛋白與殼寡糖發(fā)生了共價結(jié)合。與玉米醇溶蛋白和交聯(lián)玉米醇溶蛋白相比，糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性顯著降低，表明其水溶性顯著改善；糖基化玉米醇溶蛋白的抗氧化活性（包括DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基清除活性，還原力和亞鐵離子螯合能力）顯著提高；糖基化玉米醇溶蛋白的持水性、吸油性、乳化性和Zeta電位的絕對值均顯著降低，而起泡性顯著高于玉米醇溶蛋白，但低于交聯(lián)玉米醇溶蛋白。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為糖基化玉米醇溶蛋白在食品工業(yè)的應(yīng)用提供參考。例如，吸油性低的蛋白質(zhì)可用于油炸食品的制作可以減少對油的吸留量；溶解性好且具有良好抗氧化活性的蛋白質(zhì)可以取代或部分取代化學(xué)抗氧化劑應(yīng)用于肉類等食品加工中。

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