基于SPME-GC-MS法比較新疆哈薩克族不同居住區(qū)奶酪風(fēng)味差異

鄭曉吉，劉 飛，任全路，李寶坤，李開雄，諸葛斌*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 241112；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；3.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

我國(guó)新疆地區(qū)地域廣袤、少數(shù)民族眾多。豐富的養(yǎng)殖業(yè)造成多樣乳品的出現(xiàn)，如干酪、半成熟干酪、奶豆腐等加工產(chǎn)品。新疆哈薩克族主要分布在伊犁哈薩克自治州、阿勒泰、塔城及木壘哈薩克自治縣和巴里坤哈薩克自治縣等。奶酪是哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品之一，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富。與西方奶酪相比，哈薩克族奶酪屬于傳統(tǒng)自然發(fā)酵，因地域、氣候條件、制作工藝的不同，奶酪風(fēng)味迥異。奶酪的風(fēng)味主要來源于大多數(shù)揮發(fā)性化合物如酸類、醇類、酯類、酮類、醛類、萜烯類化合物等，而且不同奶酪具有獨(dú)特的揮發(fā)性組分[1-3]。目前，西方不同奶酪風(fēng)味物質(zhì)的研究較多[4-5]，在特征風(fēng)味分析方面已形成了系統(tǒng)的研究體系[6]。Uregeghe等[7]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)一種意大利奶酪中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其風(fēng)味成分主要由羧酸、酯、酮和醇等一些小分子化合物組成。張碩等[8]研究地區(qū)添加內(nèi)源性脂肪酶奶酪中揮發(fā)性成分物質(zhì)增加，風(fēng)味也得到改善。衣宇佳[9]研究干酪不同成熟期的風(fēng)味組分變化，干酪成熟至90 d時(shí)，2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2-庚酮、2-壬酮、異丁酸、戊酸和癸酸為其特征風(fēng)味組分貢獻(xiàn)較大的化合物。目前我國(guó)傳統(tǒng)奶酪風(fēng)味方面的研究工作已經(jīng)初步開展[10-15]，但對(duì)于新疆哈薩克少數(shù)民族不同地區(qū)傳統(tǒng)奶酪風(fēng)味組分方面的研究較少。新疆哈薩克族奶酪產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制不明晰、風(fēng)味品質(zhì)不穩(wěn)定等科學(xué)問題已成為產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的瓶頸，嚴(yán)重制約了手工制作向產(chǎn)業(yè)化加工轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)以新疆不同地區(qū)的哈薩克族奶酪為研究對(duì)象，采用SPME-GC-MS解析形成奶酪風(fēng)味的特征化合物，為開發(fā)適合于新疆哈薩克族民族奶酪的加工制作提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氯苯（色譜純）、正構(gòu)烷烴（C6～C30，色譜純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

奶酪樣品（表1）取自新疆北疆主要的哈薩克居住地區(qū)，如伊犁、阿勒泰、塔城和哈密地區(qū)。所有樣品貼上標(biāo)簽后置于車載的－4 ℃冰箱內(nèi)冷藏，12 h之內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃保存。

表1 不同哈薩克族居住區(qū)奶酪樣品采集信息Table 1 Information about different Kazak cheese samples

1.2 儀器與設(shè)備

SCION SQ 456 GC-MS聯(lián)用儀、DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Bruker公司；65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、50 μm/30 mm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME條件[16-17]

第1次使用GC萃取頭時(shí)，需對(duì)進(jìn)樣口進(jìn)行250 ℃老化1～2 h。第2次使用老化15～20 min，去除可吸附的揮發(fā)性物質(zhì)。取20 mL頂空瓶加入5 g樣品，將75 μm CAR/PDMS萃取頭老化后插入樣品瓶頂空部分，50 ℃吸附30 min，將萃取頭吸附后取出，插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)開啟儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.2 GC-MS檢測(cè)條件

載氣：高純氦氣；恒流模式0.8 mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣器：無分流進(jìn)樣1 μL；色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱；程序升溫：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至90 ℃加熱1 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃加熱7 min；離子源溫度230 ℃，電子電離源；采用多離子監(jiān)測(cè)掃描模式，電子能量70 eV。

1.3.3 揮發(fā)性化合物定性

GC-MS測(cè)定的數(shù)據(jù)由儀器自帶的系統(tǒng)軟件（Xcalibur）進(jìn)行分析處理，將奶酪樣品中揮發(fā)性成分經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索并與商業(yè)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)WILEY和NIST分析比對(duì)后，只記錄匹配度不小于800的揮發(fā)性物質(zhì)[16-19]。

1.3.4 揮發(fā)性化合物的定量

對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)鑒定進(jìn)行半定量分析，按下式進(jìn)行計(jì)算：

揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度/（mg/L）=（揮發(fā)性化合物峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積）×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，聚類分析采用R語(yǔ)言軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

SPME能有效地吸附樣品中的揮發(fā)性組分，新疆北部20 種不同哈薩克主要居住地區(qū)奶酪樣品中，經(jīng)SPME-GC-MS中共檢測(cè)出52 種主要的揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中酸類8 種，醇類14 種，酯類16 種，醛類6 種，酮類4 種，萜烯類2 種，其他類化合物2 種。各類風(fēng)味物質(zhì)種類和相對(duì)含量見表2。

20 種奶酪樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類多且復(fù)雜，不同地區(qū)樣品的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量存在一定的差異。從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分析，其中伊犁地區(qū)昭蘇縣奶酪（Y1）中鑒定出52 種化合物，以酯類、酸類和醇類化合物為主；特克斯縣（Y2）中得到46 種化合物，酯類和醇類物質(zhì)相對(duì)含量較高。阿爾泰地區(qū)可可托海、吉木乃以及塔城地區(qū)奶酪風(fēng)味物質(zhì)相似度較高，其中脂肪酸類化合物含量居多，其次是酯類化合物。塔城地區(qū)托里奶酪主要含酸類、酯類和醇類化合物；塔城和布克賽爾奶酪中含有48 種揮發(fā)性化合物，脂肪酸類化合物、酯類化合物相對(duì)含量較高，酮類化合物含量明顯高于其他樣品。阿勒泰地區(qū)布爾津樣品（A1）揮發(fā)性化合物種類和含量較低，因其樣品硬度較高，可能影響了取樣后的萃取效果。

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析和聚類分析

圖1 不同地區(qū)奶酪主成分分析圖Fig. 1 Principal component analysis of flavor compounds in Kazak cheeses

對(duì)新疆哈薩克族主要居住區(qū)20 種奶酪中52 種揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行主成分分析。由圖1可知，20 種不同地區(qū)奶酪通過風(fēng)味物質(zhì)差異可以分為3 組，伊犁地區(qū)（昭蘇、特克斯縣、伊寧、那拉提和鞏留）和哈密地區(qū)（巴里坤、伊吾縣、口門子和鹽池鄉(xiāng)）奶酪風(fēng)味物質(zhì)差異顯著，得到明顯區(qū)分。阿勒泰（布爾津、切木爾切克鄉(xiāng)、可可托海、吉木乃和阿勒泰）和塔城地區(qū)（托里多拉特鄉(xiāng)、和豐、和布克賽爾、托里和額敏）奶酪風(fēng)味成分相似度較高，歸為一類。

表2 新疆不同哈薩克族居住區(qū)奶酪樣品中揮發(fā)性組分質(zhì)量濃度Table 2 Relative concentrations of volatile components from different Kazak cheese samples mg/L

由表2和圖2可知，不同地區(qū)哈薩克族奶酪共同風(fēng)味物質(zhì)包括酸類（乙酸、丁酸、庚酸、辛酸）、醇類（乙醇、苯乙醇、3-甲基丁醇）、酯類（乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二甲酯）、酮類（2-壬酮、2-庚酮、乙偶姻）、醛類（正己醛、庚醛、壬醛）。影響20 種不同地區(qū)奶酪差異的風(fēng)味化合物主要為乙酸（AC1）、丁酸（AC3）、己酸（AC6）、乙醇（AL1）、3-甲基-1-丁醇（AL5）、2-苯乙醇（AL14）、乙酸乙酯（ES1）、己酸乙酯（ES10）、辛酸乙酯（ES12）、乙酸-2-苯乙酯（ES14）、庚醛（CB2）、壬醛（CB3）、2-庚酮（CB7）、2-壬酮（CB10）。其中壬醛是哈密地區(qū)鹽池鄉(xiāng)H5樣品與其他樣品之間差異的主要成分，乙酸是造成伊犁地區(qū)樣品與其他樣品之間差異的主要成分，2-壬酮是導(dǎo)致哈密巴里坤H1樣品與其他樣品之間差異的主要特征成分。

伊犁地區(qū)樣品主要風(fēng)味物質(zhì)為乙酸、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2-丁醇、2-羥基丙酸乙酯和2-甲基丙醇，區(qū)別于其他地區(qū)樣品。由圖2可知，伊犁地區(qū)奶酪乙酸含量明顯高于其他地區(qū)樣品，而1-辛烯-3-醇含量明顯低于哈密地區(qū)和其他奶酪樣品，而哈密地區(qū)樣品醇類物質(zhì)3-甲基-1-丁醇明顯低于其他地區(qū)。哈密地區(qū)（巴里坤、伊吾縣、口門子和鹽池鄉(xiāng)）樣品中，巴里坤（H1）風(fēng)味物質(zhì)良好，明顯區(qū)別于同地區(qū)其他樣品。主要區(qū)別在醛類（己醛、2-庚醛、壬醛、苯甲醛）、酯類物質(zhì)（丙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-丙烯酸丁酯、丁酸丁酯）和2-壬酮。

圖2 不同地區(qū)風(fēng)味物質(zhì)聚類分析熱圖Fig. 2 Heat map obtained from clustering analysis of flavor compoundsin different Kazak cheeses

2.3 不同揮發(fā)性物質(zhì)的風(fēng)味分析

圖3 不同地區(qū)樣品感官分析結(jié)果Fig. 3 Sensory analysis of cheeses from different regions

對(duì)20 種不同地區(qū)奶酪進(jìn)行10 個(gè)指標(biāo)（酸味、刺激味、甜味、咸味、肉湯味、鮮味、堅(jiān)果味、蒸煮味、顆粒感和干燥程度）進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，由圖3可知，不同地區(qū)奶酪感官分析主要差異在于酸味、刺激味和干燥程度。

2.3.1 脂肪酸類化合物

脂肪酸類物質(zhì)對(duì)于奶酪的風(fēng)味具有重要影響，奶酪發(fā)酵和成熟過程中乳脂肪或氨基酸降解形成一系列的中、短碳鏈的脂肪酸（碳原子數(shù)大于4），是奶酪最典型的特征風(fēng)味組分，也是評(píng)價(jià)奶酪成熟程度的重要標(biāo)志之一[20-21]。奶酪成熟過程中，脂肪酸類化合物主要來源于3 個(gè)主要的生化途徑：1）脂肪水解（甘油三酯水解成脂肪酸）；2）蛋白質(zhì)降解（酪蛋白降解成小分子肽和氨基酸）；3）乳糖發(fā)酵。其中乳糖經(jīng)過微生物的代謝形成奶酪的主要風(fēng)味物質(zhì)如乙酸和丙酸[13]。丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等與脂肪水解有關(guān)。此外，2-甲基丙酸和3-甲基-丁酸經(jīng)氨基酸代謝形成。乙酸是大多數(shù)奶酪的特征風(fēng)味之一，給予奶酪、胡椒、水果和花的氣味。伊犁地區(qū)奶酪乙酸含量明顯高于其他地區(qū)樣品，伊犁地區(qū)伊寧市（Y3）樣品酸類物質(zhì)如己酸、丁酸、辛酸和庚酸含量較高。己酸具有刺激味，是奶酪發(fā)酵過程中乳脂肪降解產(chǎn)生的。此外丁酸在不同地區(qū)奶酪中相對(duì)含量也較高，是原料乳中固有的脂肪酸，常常賦予奶酪特殊的酸臭味。阿爾泰地區(qū)布爾津（A1）風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，丁酸含量明顯高于其他樣品，在感官評(píng)定中酸臭味較高，和GC-MS數(shù)據(jù)分析一致。

2.3.2 酯類化合物

奶酪中酯類物質(zhì)是乳脂肪降解產(chǎn)生的短鏈脂肪酸及中長(zhǎng)鏈脂肪酸與發(fā)酵過程中乳糖發(fā)酵或氨基酸代謝產(chǎn)生的伯醇及仲醇發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生[22]。奶酪中的酯類化合物賦予奶酪甜味、水果香和花香，因而該類化合物對(duì)奶酪特征香氣的形成具有重要作用。酯類化合物如乙酸乙酯能夠賦予奶酪發(fā)酵香氣，減少由脂肪酸類化合物賦予的刺激氣味，使奶酪更加柔和[23-27]。辛酸乙酯賦予奶酪酯香和酒香，己酸乙酯能夠增強(qiáng)奶酪的果香和酒香。

20 種奶酪樣品中，共有的酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等，是哈薩克族奶酪中的特征風(fēng)味組分。此外乙酸-2-苯乙酯和3-甲基-1-丁醇乙酸酯為不同地區(qū)奶酪中相對(duì)含量較高成分，為奶酪中脂肪酸與相應(yīng)的醇類發(fā)生酯化反應(yīng)的產(chǎn)物。伊犁地區(qū)不同樣品中辛酸乙酯含量明顯高于其他地區(qū)奶酪樣品，與奶酪感官特性結(jié)果相吻合。

2.3.3 醛類化合物

奶酪中醛類化合物的形成途徑通過脂肪酸代謝、氨基酸轉(zhuǎn)氨基作用或Strecker降解[1,11]。醛類化合物易被還原成相應(yīng)的醇，因此在奶酪中的含量相對(duì)都不高。20 種不同地區(qū)奶酪中，醛類物質(zhì)主要以庚醛、己醛和壬醛為主，已有研究表明奶酪中較常見的直鏈醛類如己醛、壬醛，一般具有青草味和霉腐味，其含量一旦超過某個(gè)閾值就會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的氣味，影響奶酪感官品質(zhì)[22]。哈密巴里坤（H1）樣品中醛類物質(zhì)如壬醛、庚醛和己醛相對(duì)含量明顯高于其他地區(qū)。

2.3.4 酮類化合物

酮類化合物風(fēng)味獨(dú)特，其中甲基酮類物質(zhì)在脂肪酸β氧化的過程中形成，為乳制品中特征風(fēng)味組分。酮類化合物賦予奶酪水果味、花香味及霉腐味[23,25]。20 種不同地區(qū)奶酪中揮發(fā)性風(fēng)味分析結(jié)果表明，奶酪中酮類物質(zhì)相對(duì)較少，主要以2-庚酮、2-壬酮和乙偶姻居多。哈密地區(qū)奶酪中的酮類化合物的含量明顯高于其他地區(qū)，以2-壬酮和2-庚酮為主，這類化合物可以賦予奶酪微甜的脂蠟香氣，使其風(fēng)味變得更為豐滿，與感官分析結(jié)果相吻合。

2.3.5 醇類化合物

奶酪中醇類化合物的形成主要通過甲基酮和醛類還原、乳糖代謝、氨基酸代謝以及脂肪酸的降解[23]。不同地區(qū)哈薩克族奶酪中，醇類物質(zhì)所占比例最高也是最普遍的風(fēng)味成分。乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、正己醇、2-庚醇和1-辛醇在大部分哈薩克奶酪中均能檢測(cè)到，其中伊犁地區(qū)特克斯縣（Y2）樣品乙醇和3-甲基丁醇相對(duì)含量最高。

3-甲基-1-丁醇為新疆哈薩克族不同地區(qū)奶酪中共有的含量較高的醇類之一，奶酪成熟過程中蛋白質(zhì)分解形成的亮氨酸通過Strecker降解，經(jīng)轉(zhuǎn)氨、脫羧、還原形成[1]。3-甲基-1-丁醇也是馬蘇里拉奶酪和其他羊奶奶酪中主要醇類物質(zhì)[21,24,28]。苯乙醇在不同奶酪樣品中廣泛存在，尤其伊犁昭蘇（Y1）樣品含量最高。苯乙醇是由苯丙氨酸經(jīng)酵母菌代謝形成[29-30]，賦予奶酪的玫瑰香和發(fā)酵香，對(duì)新疆哈薩克族奶酪風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié) 論

不同地區(qū)20 種奶酪樣品中經(jīng)感官分析結(jié)合SPMEGC-MS顯示，20 種奶酪樣品中共檢測(cè)出52 種主要揮發(fā)性化合物，共有的風(fēng)味物質(zhì)包括酸類（乙酸、丁酸、庚酸、辛酸），醇類（乙醇、苯乙醇、3-甲基丁醇），酯類（乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二甲酯），酮類（2-壬酮、2-庚酮、乙偶姻），醛類（正己醛、庚醛、壬醛）等。因地域、氣候條件、制作工藝的不同，奶酪風(fēng)味迥異。其中主成分分析顯示不同地區(qū)奶酪的揮發(fā)性風(fēng)味組分差別較大，和不同地區(qū)相吻合，其中伊犁地區(qū)（昭蘇、特克斯縣、伊寧、那拉提和鞏留）和哈密地區(qū)（巴里坤、伊吾縣、口門子和鹽池鄉(xiāng)）奶酪風(fēng)味物質(zhì)差異顯著，得到明顯區(qū)分。阿勒泰（布爾津、切木爾切克鄉(xiāng)、可可托海、吉木乃和阿勒泰）和塔城地區(qū)（托里多拉特鄉(xiāng)、和豐、和布克賽爾、托里和額敏）奶酪風(fēng)味成分相似度較高，歸為一類。伊犁地區(qū)樣品主要風(fēng)味物質(zhì)為乙酸、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2-丁醇、2-羥基丙酸乙酯和2-甲基丙醇，相對(duì)含量高于其他地區(qū)樣品。哈密地區(qū)樣品中，巴里坤（H1）風(fēng)味物質(zhì)良好，明顯區(qū)別于同地區(qū)其他樣品。其醛類（己醛、2-庚醛、壬醛、苯甲醛）、酯類物質(zhì)（丙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-丙烯酸丁酯、丁酸丁酯）和2-壬酮的相對(duì)含量高于其他地區(qū)樣品。

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