直接進(jìn)樣串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查水產(chǎn)副產(chǎn)物中ω-3脂肪酸鏈磷脂

崔益瑋，俞喜娜，李詩言，戴志遠(yuǎn)，陳 康，沈 清,*

（1.浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012；3.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江 杭州 310023）

水產(chǎn)品中富含一種特殊的含長鏈多烯脂肪酸的磷脂，其sn-2位置連接一條ω-3多不飽和脂肪酸鏈，主要包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳五烯酸（docosapentenoic acid，DPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等。ω-3脂肪酸是人體不可缺少但自身又不能合成的重要營養(yǎng)元素，因此被稱為人體必需脂肪酸。已有研究表明，含ω-3脂肪酸鏈磷脂在消化吸收、穩(wěn)定性及生物利用度等活性方面優(yōu)于傳統(tǒng)ω-3脂肪酸鏈甘油酯型產(chǎn)品[1]。

ω-3脂肪酸鏈磷脂不僅具有磷脂的生理功能，還具有ω-3多不飽和脂肪酸的生理功能。醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究表明ω-3多不飽和脂肪酸對心腦血管疾病、肺病、腎病、2型糖尿病、高血壓、大腸潰瘍和節(jié)段性回腸炎的治療都會起到積極的作用[2-4]。其中EPA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、舒張血管、調(diào)整血脂等治療和預(yù)防心腦血管病的功能，EPA過氧化物和自由基可抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)，縮短染色體的端粒，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[5-6]；DPA只存在于少數(shù)海洋哺乳動物油脂中，它對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、遞質(zhì)傳導(dǎo)、促視神經(jīng)生長、改善視力、防治癌癥等具有重要作用，還可以抑制血小板凝集，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力[7-8]，其調(diào)節(jié)血脂的功能優(yōu)于EPA[9]。DHA具有調(diào)降三高健康心血管，健腦益智提高記憶力，增強(qiáng)視網(wǎng)膜反射能力以及防治老年性癡呆，以及抗癌、抗炎、抗氧化等提高生命質(zhì)量的功能[10-12]。因此，提取分離高純度ω-3脂肪酸鏈磷脂已成為發(fā)達(dá)國家竟相研究的熱點。然而天然形式的ω-3脂肪酸鏈磷脂通常含量較低，且其來源十分有限，商業(yè)上EPA、DPA及DHA磷脂的來源主要是脂肪含量高的海洋魚類[13]。隨著海況的變化和海上捕撈強(qiáng)度的不斷增加，海上漁業(yè)資源結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大變化，環(huán)境污染、過度捕撈等因素造成資源短缺，促使人們積極尋找開發(fā)富含EPA、DPA及DHA磷脂的新資源。

目前ω-3脂肪酸鏈磷脂的相關(guān)檢測方法主要以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為主，該方法根據(jù)不同色譜柱分離模式與質(zhì)譜掃描模式檢測磷脂分子結(jié)構(gòu)與含量[14-18]。成琳等[19]建立測定豆醬中活性成分磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）與其降解產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿和甘油磷脂酰膽堿含量的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，此方法準(zhǔn)確、靈敏度高、樣品處理簡單、分析時間短。王斌等[20]建立了保健膠囊中PC的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜確證方法，適用于保健膠囊中PC的檢測和確證。Shen Qing等[21-23]成功采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜建立了橄欖、杏仁、牛油果的脂質(zhì)組學(xué)快速分析方法。目前報道的方法均為定向篩選法，且分析耗時較長。

本研究擬利用質(zhì)譜直接進(jìn)樣法建立快速篩查含ω-3脂肪酸鏈磷脂的方法，快速掃描復(fù)雜樣品中含有EPA、DPA及DHA脂肪酸鏈的磷脂并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和相對含量測定，有利于快速篩選ω-3脂肪酸鏈磷脂原料資源，促進(jìn)ω-3脂肪酸鏈磷脂保健品產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產(chǎn)加工鮐魚副產(chǎn)物由舟山奧旭魚油制品有限公司提供。

PC、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanoamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%）美國Avanti Polar Lipids公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

4000 QTRAP串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及Analyst1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB Sciex公司；針泵注射進(jìn)樣器 美國Harvard公司；落地式高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；超純水系統(tǒng) 法國Milli-Q公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質(zhì)提取

稱取10 g水產(chǎn)加工副產(chǎn)物洗凈后研磨成漿，準(zhǔn)確稱取0.1 g糜液，并用二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）混合液3 mL冰浴超聲提取30 min，提取完畢后加入純水3 mL并用冷凍離心機(jī)于4 ℃、8 000 r/min離心15 min；使用移液槍移取下相溶液，向上清液和殘渣中加入2 mL二氯甲烷重復(fù)上述操作提取2次；將所有提取后所得的下相溶液合并，用氮?dú)膺M(jìn)行低溫吹干后得脂質(zhì)粗提物。將粗提物用5 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后待用。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用負(fù)離子模式下母離子掃描（precursor ion scan，PreIS），通過多通道檢測累加計算譜圖；離子噴霧電壓：4.5 kV；離子源溫度：450 ℃；去簇電壓：－100 V；碰撞電壓：－40 V；掃描范圍：350～1 150 Da；駐留時間：2 s；氣簾氣壓力：10 psi；輔助氣壓力：30 psi；針泵注射進(jìn)樣器流速：5 μL/min。以PreIS分別掃描m/z 301、329和327特征碎片離子峰，得到所有含有EPA、DPA及DHA脂肪酸鏈的磷脂。同1 d內(nèi)對同一樣品平行提取檢測5 份并計算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，同一樣品連續(xù)7 d，每天各提取檢測一次并計算日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用Analyst軟件；將譜圖經(jīng)過最低峰寬為0.2 Da噪音過濾，基線扣除4 Da，去同位素峰后得到譜圖，將譜圖導(dǎo)出為txt文件；磷脂分子通過LipidView 1.1（美國AB Sciex公司）搜庫鑒定，部分低豐度脂質(zhì)使用Lipid Mass Spec. Prediction軟件鑒定，得到各個離子峰的結(jié)構(gòu)信息；相對豐度的計算公式為：

式中：Ai為該化合物峰面積；1，2，3……n表示譜圖中的各個化合物的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖1 含ω-3脂肪酸鏈磷脂結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of phospholipids with ω-3 fatty acid chains

PreIS是一種根據(jù)化合物共有碎片離子峰，掃描含有該碎片離子峰的所有化合物母離子。PreIS是三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的一種重要模式，但是相關(guān)方法開發(fā)與應(yīng)用報道非常少[24-25]。本研究以EPA、DPA及DHA脂肪酸鏈為特征碎片離子峰（圖1），進(jìn)而以PreIS分別掃描所有含有這3 種脂肪酸鏈的磷脂，實現(xiàn)直接進(jìn)樣快速篩選優(yōu)質(zhì)磷脂資源的目的[26-28]。動物組織中磷脂主要包括PC、PE、PI、PS等，其中PC和PE是細(xì)胞磷脂雙分子層的主要成分，磷脂酰甘油和甘油磷脂酸均屬低豐度磷脂，通常檢出量較少[29]。除了PC以外磷脂均易在負(fù)離子模式下電離形成[M－H]－。PC由于膽堿較易質(zhì)子化，在正離子模式下離子峰強(qiáng)度相對較強(qiáng)，其負(fù)離子模式下電離形成[M＋Cl]－也能被順利檢測到[30]。因此，本實驗采用負(fù)離子模式監(jiān)測水產(chǎn)品副產(chǎn)物中的磷脂。去簇電壓和碰撞電壓是影響磷脂信號強(qiáng)度最顯著的因素，通過選定特征碎片進(jìn)行PreIS掃描爬坡測試，得到最佳參數(shù)為去簇電壓－100 V和碰撞電壓－40 V。磷脂的基本結(jié)構(gòu)由極性基團(tuán)和脂肪酸鏈構(gòu)成，其中單條脂肪酸鏈的碳原子數(shù)在14～22之間，考慮到溶血性磷脂，質(zhì)譜掃描范圍設(shè)定為350～1 150 Da。

2.2 EPA鏈磷脂

圖2 水產(chǎn)副產(chǎn)物中含EPA鏈磷脂質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of EPA containing phospholipids in aquatic byproducts

含EPA鏈磷脂在質(zhì)譜真空環(huán)境下經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離，其sn-2位置的EPA鏈斷裂并生成碎片離子m/z 301，因此選定該碎片為特征離子進(jìn)行PreIS掃描，樣品經(jīng)針泵直接進(jìn)樣后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集得到圖2。含EPA鏈磷脂質(zhì)譜圖特征較為明顯，共鑒定磷脂分子17 種，其中最大峰m/z 814.9相對強(qiáng)度23.2%，經(jīng)搜庫鑒定其結(jié)構(gòu)可能為[PC 16:0/20:5＋Cl]－、[PE 22:3/20:5－H]－或兩者的重疊，其后依次為m/z 736.8、764.8、816.9、762.8，結(jié)構(gòu)分別為[PE 16:0/20:5－H]－、[PE 18:0/20:5－H]－、[PE 22:2/20:5－H]－和[PE 18:1/20:5－H]－，其余離子峰強(qiáng)度相對較弱，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果見表1。根據(jù)水產(chǎn)品副產(chǎn)物中含EPA鏈磷脂結(jié)構(gòu)特征表明，其sn-1位置的脂肪酸鏈主要以C16:0、C18:1和C18∶0為主。此外還檢測到了2 條脂肪酸鏈均為EPA結(jié)構(gòu)的磷脂，如PS 20:5/20:5（m/z 826.9）；同時含DPA和EPA鏈結(jié)構(gòu)的磷脂，如PI 22:5/20:5（m/z 841.9），以及溶血性磷脂lysoPC 20:5（m/z 577.1）。

表1 水產(chǎn)副產(chǎn)物中EPA鏈磷脂相對豐度和分子結(jié)構(gòu)Table 1 Relative abundances and chemical structures of EPA containing phospholipids in aquatic byproducts

2.3 DPA鏈磷脂

含DPA鏈磷脂經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離，其sn-2位置的DPA鏈斷裂并生成碎片離子m/z 329，因此選定該碎片為特征離子進(jìn)行PreIS掃描得圖3。含DPA鏈磷脂分子種類多樣，共鑒定磷脂分子17 種，其推測結(jié)構(gòu)和相對含量見表2，其中m/z 791.0（[PE 18:1/22:5－H]－）和m/z 842.8（[PC 16:0/22:5－H]－）為信號相對最強(qiáng)的磷脂分子，分別為18.7%和16.1%。水產(chǎn)品副產(chǎn)物中含DPA鏈磷脂的sn-1位置的脂肪酸鏈除C16:0、C18:1和C18:0結(jié)構(gòu)外，C20:1和C22:2信號也較強(qiáng)，如m/z 818.9（[PE 20:1/22:5－H]－）和m/z 844.8（[PE 22:2/22:5－H]－）。水產(chǎn)品副產(chǎn)物中DPA鏈磷脂分子種類豐富，且較傳統(tǒng)的游離型、乙酯型和甘油三酯型DPA在消化吸收以及營養(yǎng)功效方面更加優(yōu)越。因此，以水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為原料開發(fā)ω-3脂肪酸鏈磷脂保健功能產(chǎn)品潛力較大。

圖3 水產(chǎn)副產(chǎn)物中含DPA鏈磷脂質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of DPA containing phospholipids in aquatic byproducts

表2 水產(chǎn)副產(chǎn)物中DPA鏈磷脂相對豐度和分子結(jié)構(gòu)Table 2 Relative abundances and chemical structures of DPA containing phospholipids in aquatic byproducts

2.4 DHA鏈磷脂

本方法在檢測DHA鏈磷脂方面不同于目前常用的自上而下篩選法，即先鑒定所有磷脂分子結(jié)構(gòu)，再從其中篩選含DHA鏈磷脂，而是采用自下而上的策略，即特異性篩查含DHA鏈磷脂，自動過濾非目標(biāo)化合物。含DHA鏈磷脂經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離，其sn-2位置的DHA鏈斷裂并生成碎片離子m/z 327，因此選定該碎片為特征離子進(jìn)行PreIS掃描得圖4。離子峰m/z 840.9信號最強(qiáng)，相對豐度為20.8%，其結(jié)構(gòu)鑒定為[PC 16:0/22:6－H]－和[PE 22:2/22:6－H]－。其后依次為m/z 788.9（14.5%）、m/z 790.9（11.1%）和m/z 866.8（9.6%），結(jié)構(gòu)分別為[PE 18:1/22:6－H]－、[PE 18:0/22:6－H]－和[PC 18:1/22:6－H]－，其余離子峰強(qiáng)度相對較弱，經(jīng)鑒定結(jié)果見表3。水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中DHA磷脂種類豐富，共鑒定16 種磷脂分子，部分磷脂不飽和度極高，如PS 20:5/22:6和PI 22:6/22:6，相對豐度分別為1.9%和3.6%。DHA是人體無法自身合成具有重要保健功能的脂質(zhì)，本方法可一步快速篩查樣品中含DHA鏈磷脂，為探索與發(fā)現(xiàn)磷脂新資源提供重要支持。

圖4 水產(chǎn)副產(chǎn)物中含DHA鏈磷脂質(zhì)譜圖Fig. 4 Mass spectrum of DHA containing phospholipids in aquatic byproducts

表3 水產(chǎn)副產(chǎn)物中DHA鏈磷脂相對豐度和分子結(jié)構(gòu)Table 3 Relative abundances and chemical structures of DHA containing phospholipids in aquatic byproducts

2.5 方法重復(fù)性實驗結(jié)果

本實驗針對每類ω-3脂肪酸磷脂選取高低豐度各兩種磷脂分子，EPA磷脂（m/z 814.9、736.8、765.8和767.8）、DPA磷脂（m/z 790.0、842.9、793.9和816.8）、DHA磷脂（m/z 840.8、788.9、763.6和854.8），通過同1 d內(nèi)對同一樣品平行提取檢測5 份以及同一樣品連續(xù)7 d每天各提取檢測一次的方式，計算日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表4。結(jié)果表明，所有磷脂分子相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于7.3%，PreIS模式下質(zhì)譜數(shù)據(jù)穩(wěn)定性較好。

m/z EPA DPA DHA 814.9736.8765.8767.8 790.0842.9793.9816.8 840..8788.9763.6854.8相對標(biāo)準(zhǔn) 日內(nèi) 4.6 4.3 4.2 3.7 3.9 3.6 4.1 3.8 3.2 2.8 2.4 3.3偏差/% 日間 7.3 7.1 6.9 6.5 6.5 6.3 7.0 6.4 6.1 5.9 5.5 6.1項目

3 結(jié) 論

ω-3脂肪酸鏈磷脂不僅具有磷脂的生理功能，還具有ω-3多不飽和脂肪酸的生理功能，比傳統(tǒng)的游離型和甘油三酯型ω-3脂肪酸在消化吸收和營養(yǎng)功效方面更佳。目前含EPA、DPA和DHA鏈磷脂的檢測方法均為自上而下篩選法，即先鑒定所有磷脂分子結(jié)構(gòu)，再從其中篩選目標(biāo)磷脂。本方法采用針泵注射進(jìn)樣，以m/z 301、329和327為特征碎片離子峰掃描含EPA、DPA和DHA鏈磷脂質(zhì)譜全譜圖，譜圖內(nèi)離子峰均為目標(biāo)磷脂，無雜質(zhì)峰干擾。該方法可大大簡化后期數(shù)據(jù)處理與鑒定分析，方法穩(wěn)定可靠，為快速篩查ω-3脂肪酸鏈磷脂資源提供重要技術(shù)手段。

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