堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽的研究

師小飛，李明生

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030）

0 引言

隨著我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國每年宰殺肉雞量已超過1×109只，每只雞的血液含量為90 g左右，而這些雞血通常作為廢棄物排放，并未得到有效利用，不僅浪費(fèi)資源，而且容易污染環(huán)境[1-2]。雞血富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、無機(jī)鹽、微量元素、酶類及其他生物活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊[3-5]。近年來，利用動(dòng)物血液為原料制備抗氧化肽[6-8]、抗菌肽[9-11]、ACE抑制肽[12-13]等生物活性多肽的研究越來越多，為動(dòng)物血液資源的綜合利用提供了一條新途徑，但利用雞血清制備ACE抑制肽的研究卻鮮有報(bào)道。試驗(yàn)采用堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽，通過單因素試驗(yàn)對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為雞血資源在功能性食品及醫(yī)藥方面的利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

雞血清蛋白：新鮮雞血采取于甘肅省蘭州市榆中縣，提取血清蛋白后經(jīng)真空冷凍干燥，于-20℃條件下保存待用。

1.1.2 試劑

堿性蛋白酶（150 000 U/g），北京中生瑞泰科技有限公司提供；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL），美國Sigma公司提供；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），于市售新鮮豬肺中提??；茚三酮、酪氨酸、鹽酸、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸酐、吡啶等其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PB-10型便攜式臺式酸度計(jì)，北京格拉威爾公司產(chǎn)品；JA2003N型電子天平，上海天平儀器廠產(chǎn)品；UV2000型紫外可見分光光度計(jì)，龍泥柯儀器有限公司產(chǎn)品；TCL-16M型高速臺式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；WS28型電熱恒溫水浴鍋，西安禾普生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞血清蛋白酶解液的制備

稱取適量的雞血清蛋白粉，加入100 mL雙蒸水溶解，配制成一定濃度的雞血清蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值至一定數(shù)值，按照一定的比例加入堿性蛋白酶，在特定溫度下水解一定時(shí)間，之后于95℃恒溫下水浴滅酶15 min，冷卻至室溫后，過濾，得到濾液待用。

1.2.2 雞血清蛋白水解度的測定

采用茚三酮比色法[14]測定雞血清蛋白水解度（Degree of Hydrolysis，DH），公式如下：

不過說實(shí)話，呼倫對專家并不抱多大希望。他要寫成這篇文章，其實(shí)還是虛榮心在做怪。三萬字啊，多大的篇幅！拿給同事們看，他們從此還不得高看他呼倫一眼？——何況還有稿費(fèi)?！螞r還能給單調(diào)的日子找些事做?！螞r還是國內(nèi)空白?！螞r，還真的有可能成為專家。

式中：A0——水解前雞血清蛋白溶液本身含有的游離氨基酸數(shù)，mmol；

A1——雞血清蛋白完全酸水解后含有的游離氨基酸數(shù)，mmol;

A2——雞血清蛋白酶解液含有的游離氨基酸數(shù)，mmol。

1.2.3 雞血清多肽ACE抑制率的測定

采用高丹丹等人[15]的方法測定雞血清多肽的ACE抑制率。取0.1 mL 5.0 mmol/L的HHL溶液于離心管中，加入0.1 mL雞血清蛋白酶解液，混勻，再加入0.1 mL ACE酶液，于37℃條件下反應(yīng)1 h，然后立即加入0.25 mL 1.0 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，振蕩2 min后靜置；之后加入1.5 mL乙酸乙酯，并劇烈振蕩以萃取反應(yīng)生成的馬尿酸，于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min；吸取1.0 mL含有馬尿酸的乙酸乙酯于另一個(gè)新離心管中，再往新離心管中加入1.0 mL乙酸酐、2.0 mL 0.5%DAB顯色劑，于40℃條件下顯色30 min，之后測定其在459 nm處的OD值，并根據(jù)以下公式計(jì)算：

式中：A——用雙蒸水代替雞血清蛋白酶解液所測得的OD值；

S——添加雞血清蛋白酶解液所測得的OD值；

C——添加乙酸乙酯、乙酸酐和顯色劑的參比OD值。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以雞血清蛋白的水解度及其酶解液的ACE抑制率為指標(biāo)，在pH值為8.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶與底物濃度比6 000 U/g，時(shí)間3 h的條件下，研究不同溫度（分別為40，45，50，55，60℃） 對水解效果的影響；在溫度50℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶與底物濃度比6 000 U/g，時(shí)間3 h的條件下，研究不同pH值（分別為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0） 對水解效果的影響；在溫度50℃，pH值8.0，酶與底物濃度比為6 000 U/g，時(shí)間3 h的條件下，研究不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別為2%，4%，6%，8%，10%）對水解效果的影響；在溫度50℃，pH值8.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，時(shí)間3 h的條件下，研究不同酶與底物濃度比 （分別為 4 000，5 000，6 000，7 000，8 000 U/g）對水解效果的影響；在溫度50℃，pH值8.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶與底物濃度比為6 000 U/g的條件下，研究不同時(shí)間（分別為1，2，3，4，5 h） 對水解效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對水解效果的影響

溫度對水解效果的影響見圖1。

圖1 溫度對水解效果的影響

由圖1可知，在40～60℃，隨著溫度升高，其ACE抑制率和水解度均先增大后減小，在50℃達(dá)到最大值，分別為57.53%±0.98%和15.07%±0.72%，此時(shí)水解效果最好。這是因?yàn)闇囟葘γ复俜磻?yīng)效率影響顯著，每種蛋白酶都有最適反應(yīng)溫度。一方面，當(dāng)溫度低于最適反應(yīng)溫度時(shí)，隨著溫度的升高，酶活性增強(qiáng)，酶促反應(yīng)速率加快，水解效果也隨之變好；另一方面，當(dāng)溫度高于最適反應(yīng)溫度時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，酶蛋白會(huì)慢慢發(fā)生變性，酶活性減弱，酶促反應(yīng)速率減慢，水解效果也隨之變差[16]。因此，50℃為堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽的最適反應(yīng)溫度。

2.2 pH值對水解效果的影響

pH值對水解效果的影響見圖2。

由圖2可知，其ACE抑制率和水解度隨著pH值的升高，呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，且在pH值為8.0時(shí)，具有最好的水解效果，分別達(dá)到56.84%±0.80%和15.70%±0.67%，pH值低于或高于8.0，其ACE抑制率和水解度均有不同程度的降低。這是因?yàn)槊恳环N蛋白酶根據(jù)自身特性的不同，都有最適合的反應(yīng)pH值，在此條件下，反應(yīng)底物可以與蛋白酶的催化活性中心充分結(jié)合，從而使蛋白酶最大限度地發(fā)揮其催化作用，得到更多的目標(biāo)水解產(chǎn)物，pH值過高或過低，位于蛋白酶催化活性部位的可解離基團(tuán)都不能得到充分解離，其催化活性都會(huì)受到一定程度的抑制[17]。因此，確定8.0為堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽的最適pH值。

圖2 pH值對水解效果的影響

2.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解效果的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解效果的影響見圖3。

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解效果的影響

由圖3可知，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～6%時(shí)，其ACE抑制率和水解度隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大逐漸升高，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，達(dá)到最大值，分別為57.86%±0.65%和16.29%±0.41%，之后隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，其ACE抑制率和水解度則呈現(xiàn)出下降趨勢。這是因?yàn)橐环矫娈?dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過低時(shí)，過量蛋白酶的存在反而會(huì)抑制酶促反應(yīng)的充分進(jìn)行，從而導(dǎo)致水解效果變差；另一方面當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，溶液過于黏稠，蛋白酶的催化作用受到抑制，從而也會(huì)導(dǎo)致水解效果變差。因此，確定堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽的最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%。

2.4 酶與底物濃度比對水解效果影響

酶與底物濃度比對水解效果的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)酶與底物濃度比低于6 000 U/g時(shí)，隨著蛋白酶用量的增加，其ACE抑制率和水解度均呈現(xiàn)出增大的趨勢，此后隨著酶與底物濃度比繼續(xù)增大，水解度緩慢上升，但增長速率明顯降低，而ACE抑制率則略有下降。這是因?yàn)樵谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)，隨著酶用量的增加，酶促反應(yīng)速率加快，水解效果逐漸變好，而當(dāng)加酶量超出一定范圍后，蛋白酶的量慢慢趨于飽和，底物的量也逐漸略顯不足，此時(shí)繼續(xù)增加蛋白酶用量對水解度不會(huì)產(chǎn)生顯著影響，而ACE抑制率略有下降，可能是因?yàn)槟繕?biāo)產(chǎn)物在過量的蛋白酶的作用下發(fā)生進(jìn)一步水解造成的。因此，確定6 000 U/g為堿性蛋白酶水解雞血清蛋白的最適酶與底物濃度比，此時(shí)其ACE抑制率和水解度分別為56.08%±0.19%和16.22%±0.86%。

圖4 酶與底物濃度比對水解效果的影響

2.5 時(shí)間對水解效果的影響

時(shí)間對水解效果的影響見圖5。

圖5 時(shí)間對水解效果的影響

由圖5可知，水解度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸增大，但3 h之后增長速率明顯下降，ACE抑制率在4 h之前隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)出上升趨勢，之后略有降低。這是因?yàn)殡S著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長，底物濃度逐漸變小，產(chǎn)物濃度逐漸變大，兩者之間的競爭性抑制作用逐漸變強(qiáng)，酶的活性也逐漸降低[6]。因此，考慮到節(jié)約時(shí)間和能源，確定堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽的最佳反應(yīng)時(shí)間為4 h，此時(shí)其ACE抑制率和水解度分別為63.07%±0.69%和17.22%±0.31%。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽，以ACE抑制率和水解度為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究了溫度、pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶與底物濃度比、時(shí)間對水解效果的影響，確定了堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽最佳工藝條件為溫度50℃，pH值8.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶與底物濃度比6 000 U/g，時(shí)間4 h，此反應(yīng)條件下其ACE抑制率和水解度分別為63.07%±0.69%和17.22%±0.31%。通過單因素試驗(yàn)得到了堿性蛋白酶水解雞血清蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝條件，為雞血資源的綜合利用提供新途徑，為雞血清蛋白ACE抑制肽的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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