任德強(qiáng)，張立恒，宋新剛

（哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025）

利用有限稀釋法和單細(xì)胞顯微操作法從現(xiàn)有 ST細(xì)胞系中克隆出一株對(duì)豬細(xì)小病毒H株具有高敏感性的細(xì)胞克隆株 ST-5,初步研究該克隆株對(duì)豬細(xì)小病毒H株增殖的特性及穩(wěn)定性。該克隆株連續(xù)傳代 20代后對(duì)豬細(xì)小病毒H株感染性不變,病毒滴度最高可達(dá)107.0TCID50/mL。這一研究結(jié)果將有利于開(kāi)發(fā)高效價(jià)的豬細(xì)小病毒H株滅活疫苗。

1 材料和方法

1.1 試劑培養(yǎng)液MEM(Gibco)；胎牛血清FBS(Gibco)；二甲基亞砜(Sigma)；Trypsin-EDTA(Gibco)。

1.2 毒株和細(xì)胞系豬細(xì)小病毒H株，實(shí)驗(yàn)室鑒定、保管和供應(yīng)；ST傳代細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(HF240型)，HealForce公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning公司；倒置顯微鏡(TS100)，Nikon 公司。

1.4 方法

1.4.1 有限稀釋法將需要克隆的細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)液稀釋至40～50個(gè)細(xì)胞/mL，96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔加0.1mL（4～5個(gè)細(xì)胞/孔)，接種2排，剩余細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排，如此類推，直至使每孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)6～9d后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔。

1.4.2 單細(xì)胞顯微操作法加入培養(yǎng)皿內(nèi)供選擇的細(xì)胞數(shù)在30～100。選擇大小一致、適中、形態(tài)良好的細(xì)胞，選擇位置遠(yuǎn)離其他細(xì)胞的細(xì)胞，找到合適細(xì)胞，用吸頭尖對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞后吸入細(xì)胞。培養(yǎng)板每孔放入1個(gè)細(xì)胞。以加入細(xì)胞后用吸頭在液面輕吹出氣泡為標(biāo)志。次日顯微鏡下觀察確認(rèn)并標(biāo)記單克隆穴。1周左右(期間要在顯微鏡下多次觀察確認(rèn)標(biāo)記篩選優(yōu)異的單克隆穴)，當(dāng)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)到1／3以上視野時(shí)，消化并轉(zhuǎn)種于24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4.3 病毒培養(yǎng)參照病毒制造規(guī)程進(jìn)行病毒培養(yǎng)與收獲。

1.4.4 檢測(cè)方法

（1）HA測(cè)定紅細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法自 HA效價(jià)低的豚鼠的心臟采血，用pH7.2 PBS配成0.6%紅細(xì)胞懸液備用。測(cè)定病毒液的血凝價(jià)。

（2）TCID50測(cè)定 96孔微量培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL，將待測(cè)病毒液分別作 10-1～10-7倍梯度稀釋，每稀釋度 6孔，每孔加入不同稀釋度的病毒液 100mL，細(xì)胞對(duì)照組加 100μL細(xì)胞稀釋液。置 5%CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng)，逐日記錄 CPE出現(xiàn)孔，觀察到120h為止，按 Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。

1.4.5 敏感性檢測(cè) 階段性取細(xì)胞狀態(tài)好的細(xì)胞株接種病毒，培養(yǎng)液作HA和TCID50檢測(cè)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果，篩選最優(yōu)的克隆細(xì)胞株，大量?jī)龃姹４鎮(zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 克隆細(xì)胞篩選單細(xì)胞顯微鏡操作法篩選出7株、稀釋法篩選出1株生長(zhǎng)良好的單克隆細(xì)胞株。

2.2 敏感性檢測(cè)

表1 PPVH株在不同ST細(xì)胞株增殖的TCID50和HA

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法的比較

本次克隆細(xì)胞用有限稀釋法、單細(xì)胞顯微操作法和細(xì)胞克隆技術(shù)。有限稀釋法克隆技術(shù)篩選細(xì)胞最為常見(jiàn)。但操作繁瑣，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的要求高，獲得單克隆孔穴的比率較低，需克隆次數(shù)多，耗材多，顯微鏡下確認(rèn)工作量大。結(jié)果也不理想。與有限稀釋法比，單細(xì)胞顯微操作法可最大限度提高單克隆孔穴的比率?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要預(yù)先設(shè)計(jì)克隆數(shù)。本方法所需克隆母細(xì)胞極少，縮短了前期培養(yǎng)時(shí)間。在確有把握肯定每次單選又不需大量克隆時(shí)，就不要選取滿96孔板全部孔穴。這樣也可節(jié)省時(shí)間，減輕后續(xù)工作量和節(jié)約耗材。總之，本實(shí)驗(yàn)采用的單細(xì)胞顯微操作法克隆技術(shù)，減少了克隆次數(shù)，提高了工作效率。

3.2 敏感性

PPV凝血活性間接反映其生物活性。為了比較全面的評(píng)價(jià)PPV活性，本研究同時(shí)測(cè)定病毒含量和其血凝效價(jià)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記為克隆細(xì)胞株ST-5對(duì)豬細(xì)小病毒H株最為敏感，對(duì)提升疫苗生產(chǎn)能力意義很大。

[1]司徒鎮(zhèn)強(qiáng),等.細(xì)胞培養(yǎng).北京∶世界圖書(shū)出版公司2000．227-231．

[2]馬世興．準(zhǔn)確快速的細(xì)胞克隆化試驗(yàn)研究．單克隆抗體通訊，1993，9(2)：70-72．

[3]朱紹輝，等．豬細(xì)小病毒X株在不同細(xì)胞上增殖效果比較[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，6：6-10．

[4]中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典[M]．2010年版三部．中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，附錄7.