劉登勇,吳金城,王繼業(yè),戚 軍,徐幸蓮

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

醬鹵肉制品是中華傳統(tǒng)熟肉制品的典型代表,一般是原料肉在水中加調(diào)味料、香辛料等煮制而成[1]。溝幫子熏雞是我國(guó)著名的地方特色醬鹵肉制品之一,與德州扒雞、道口燒雞、符離集燒雞并稱“四大名雞”[2]。溝幫子熏雞加工工藝主要包括原料選擇與處理、浸泡、煮制、熏制等[3]。秘制配方和獨(dú)特工藝賦予溝幫子熏雞造型優(yōu)美、色艷味佳、肥而不膩、軟爛連絲等特點(diǎn),深受消費(fèi)者喜愛(ài)。

目前有關(guān)醬鹵肉制品揮發(fā)性成分的研究較多,王學(xué)敬等[4]利用固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析了德州扒雞的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),熊國(guó)遠(yuǎn)[5]分析比較了不同加工階段符離集燒雞的揮發(fā)性風(fēng)味組分,張逸君等[6]對(duì)道口燒雞揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,孫圳等[7]研究了定量鹵制過(guò)程及傳統(tǒng)鹵制雞腿肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分,但是關(guān)于溝幫子熏雞風(fēng)味的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

固相微萃取(solid phase micro extraction,SPME)是一種被廣泛地應(yīng)用于食品揮發(fā)性風(fēng)味成分分析的前處理技術(shù)[8],但各類食品的適宜萃取條件不同。因此,本實(shí)驗(yàn)以溝幫子熏雞為對(duì)象,對(duì)影響風(fēng)味物質(zhì)萃取的相關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography and mass spectrometry,GC-MS)技術(shù)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定,并對(duì)各風(fēng)味成分的相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)進(jìn)行計(jì)算和分析[9],探明溝幫子熏雞主體風(fēng)味成分,為以后香氣檢測(cè)和研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熏雞樣品 錦州市溝幫子熏雞專賣店,質(zhì)量1000～1300 g/只,選取當(dāng)日生產(chǎn)、未經(jīng)二次殺菌的散裝產(chǎn)品,真空包裝后置于-18 ℃貯藏備用。

Agilent 7890N/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;固相微萃取裝置、20 mL頂空鉗口樣品瓶、4種不同涂層SPME萃取針(表1) 美國(guó)Supelco公司。

表1 4種不同涂層SPME萃取針Table 1 Four types of fibers with different coatings

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理與SPME萃取 將冷凍熏雞樣品置于4 ℃條件下緩慢解凍12 h,稱取胸肉、腿肉各100 g(帶皮),分別切成2 mm×2 mm×2 mm大小,混勻。

將適量樣品轉(zhuǎn)移至20 mL頂空瓶中,快速用聚四氟乙烯隔墊迅速封口,一定的溫度水浴加熱。用萃取針(已活化)頂空吸附后,將萃取針插入氣相色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)行解吸。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 GC-MS條件 氣相色譜條件:毛細(xì)管柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);前進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣(He)流速1.0 mL/min;不分流模式進(jìn)樣;程序升溫:初始柱溫40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至70 ℃,以5 ℃/min升至180 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

質(zhì)譜條件:色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;離子化方式EI;電子能量70eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 30～550。

1.2.3 定性和定量分析 樣品中的揮發(fā)性成分經(jīng)氣相色譜分離后,用質(zhì)譜進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果通過(guò)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(Nist/Wiley)進(jìn)行檢索,選擇匹配度大于80的檢索結(jié)果(總值100),各化合物峰面積由軟件系統(tǒng)計(jì)算。利用面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性成分在熏雞揮發(fā)性氣味物質(zhì)中的相對(duì)含量。參考劉登勇等[9]的方法計(jì)算各成分的ROAV,并據(jù)此確定主體風(fēng)味成分。

1.3 SPME條件優(yōu)化

1.3.1 萃取針選取 為獲得溝幫子熏雞揮發(fā)性物質(zhì)的優(yōu)化條件,固定樣品質(zhì)量4.0 g、預(yù)熱溫度50 ℃、預(yù)熱時(shí)間10 min、萃取溫度51 ℃、萃取時(shí)間45 min、解析溫度240 ℃、解析時(shí)間4 min,考察4種不同涂層SPME萃取針(表1)對(duì)熏雞揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積的影響。

1.3.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選顯著性影響因素 采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法,對(duì)預(yù)熱溫度、預(yù)熱時(shí)間、萃取溫度、萃取時(shí)間、解吸溫度、解吸時(shí)間、樣品質(zhì)量等影響響應(yīng)變量(y)的7個(gè)因素進(jìn)行分析[10]。如表2所示,每個(gè)因素取兩水平,即低水平(-1)和高水平(+1)。以除去萃取針解吸產(chǎn)生的含硅雜質(zhì)后的總峰面積為響應(yīng)指標(biāo),篩選出對(duì)結(jié)果有顯著影響(p<0.05)的因素。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)中的因素水平表Table 2 Experimental variables and levels of Plackett-Burman design

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)篩選結(jié)果進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以總峰面積為優(yōu)先考察指標(biāo)并輔以物質(zhì)出峰數(shù)為參考,綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)條件。具體方法如下:

樣品質(zhì)量4.0 g、萃取時(shí)間50 min條件下,考察萃取溫度40、43、47、51、55 ℃ 5個(gè)水平對(duì)總峰面積的影響。

樣品質(zhì)量4.0 g、萃取溫度51 ℃條件下,設(shè)定萃取時(shí)間為30、35、40、45、50 min,研究萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響。

萃取溫度51 ℃、萃取時(shí)間45 min,樣品質(zhì)量取3、3.5、4、4.5、5 g 5個(gè)水平,考察樣品質(zhì)量對(duì)總峰面積的影響。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn) 通過(guò)表3所示因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析并驗(yàn)證,最終確定SPME-GC-MS法分析熏雞風(fēng)味物質(zhì)的分析條件。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of L9(34)orthogonal design

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Minitabl6軟件分析Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果;使用SAS Version 9.1.3軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME條件優(yōu)化

2.1.1 不同涂層萃取針的初步篩選 本文用4種不同涂層固相微萃取針(表1)對(duì)熏雞揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取。由圖1可知,CAR/PDMS(75 μm)的萃取針萃取到的揮發(fā)性物質(zhì)峰面積最大,達(dá)到8.584×108,PDMS/DVB(65 μm)萃取針次之。原因可能是熏雞揮發(fā)性物質(zhì)中極性物質(zhì)較多,導(dǎo)致非極性萃取針的效果最差,雙極性萃取針具有萃取范圍較廣的特點(diǎn),其對(duì)極性揮發(fā)性物質(zhì)較多的樣品萃取效果不佳[11]。為獲得最大的揮發(fā)性組分信息,本實(shí)驗(yàn)選擇CAR/PSMS(75 μm)萃取針進(jìn)一步對(duì)熏雞進(jìn)行風(fēng)味研究。

圖1 不同萃取針對(duì)揮發(fā)性成分萃取的影響Fig.1 Effect of fiber coating on the peak areas of volatiles注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.1.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選顯著性影響因素 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表4,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表5。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)來(lái)分析較多的影響因素,僅需考慮各因素引起的主效應(yīng),而忽略因素之間交互作用,因此該實(shí)驗(yàn)用于篩選顯著影響因素(p<0.05)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況確定非顯著影響因素(p>0.05)的取值[10]。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸蛩氐闹餍?yīng)p值為0.012,說(shuō)明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性,不同影響因素對(duì)應(yīng)p值反映了該因素的顯著性,表5中萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品質(zhì)量3個(gè)因素為顯著影響因素(p<0.05),通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明其對(duì)萃取效果的影響;其余因素為非顯著影響因素(p>0.05),在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件范圍內(nèi)選取條件即可,具體取值為預(yù)熱溫度50 ℃、預(yù)熱時(shí)間10 min、解吸溫度240 ℃、解吸時(shí)間4 min。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman因素影響表Table 5 Significance of factors in Plackett-Burman experiments

2.1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.3.1 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響 溫度過(guò)低則不利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā),影響萃取效果。較高萃取溫度下待測(cè)樣品二次加熱,可能導(dǎo)致新物質(zhì)產(chǎn)生及物質(zhì)之間發(fā)生一些熱反應(yīng)。由圖2可知,萃取溫度達(dá)55 ℃時(shí),峰面積達(dá)到最大值8.87×108,但與51 ℃差異性不顯著(p>0.05),綜上分析,最佳萃取溫度應(yīng)在51～55 ℃范圍。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on efficiency注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05),相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(p>0.05)。圖3、圖4同。

2.1.3.2 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響 SPME的原理是揮發(fā)性物質(zhì)頂空濃度與萃取針涂層吸附濃度的分配平衡過(guò)程,且動(dòng)態(tài)平衡時(shí),萃取針涂層對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)吸附量與其初始頂空濃度呈正比[12]。同時(shí)待測(cè)樣品的各成分達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡所需時(shí)間不同。因此在一定范圍內(nèi)控制每次實(shí)驗(yàn)的萃取時(shí)間,結(jié)果具有可比性。由圖3可知,隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積有上升趨勢(shì),45 min后響應(yīng)值增加不顯著(p>0.05)。為提高檢驗(yàn)效率,萃取時(shí)間應(yīng)選擇45 min。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Influence of extraction time on extraction efficiency

2.1.3.3 樣品質(zhì)量對(duì)萃取效果的影響 樣品質(zhì)量對(duì)萃取效果的影響見(jiàn)圖4。一般各類樣品所需最適樣品質(zhì)量不盡相同。以總峰面積為考察指標(biāo),隨樣品質(zhì)量的升高,總峰面積先升后降再逐漸升高,并在樣品質(zhì)量4.5 g時(shí)達(dá)到最大值。而樣品質(zhì)量為5 g時(shí),可能由于頂空瓶中頂空體積變小,香氣成分未從樣品中充分揮發(fā),導(dǎo)致總峰面積略有下降。因此在該實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境下,樣品質(zhì)量應(yīng)選擇4.5 g。

圖4 樣品質(zhì)量對(duì)萃取效果的影響Fig.4 Influence of sample mass on extraction efficiency

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9(34),以萃取溫度(A)、萃取時(shí)間(B)、樣品質(zhì)量(C)為因素,總峰面積作為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表6。由結(jié)果可知萃取溫度對(duì)于總峰面積影響最大,萃取時(shí)間次之,樣品質(zhì)量影響最小,優(yōu)組合應(yīng)為A3B2C1,即55 ℃、45 min、4.0 g，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到峰面積平均值為14.846×108。同時(shí)比較預(yù)熱溫度對(duì)萃取效果的影響,結(jié)果表明55 ℃萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)峰面積最大。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal test

2.2 熏雞風(fēng)味物質(zhì)成分分析

在最優(yōu)條件下測(cè)定溝幫子熏雞風(fēng)味物質(zhì)成分共72種,包括烴類26種、醇類7種、醛類8種、酮類3種、酸類7種、酯類5種、酚類5種、醚類4種及其它化合物7種。其中,烷烴類物質(zhì)及大分子烯烴類物質(zhì)閾值很高,除個(gè)別物質(zhì)外,幾乎不產(chǎn)生明顯嗅感;16個(gè)碳原子以上的醇類、醛類、羧酸類和酯類等物質(zhì)在食品中正常的濃度范圍內(nèi)幾乎沒(méi)有氣味[13];這些化合物雖然含量累計(jì)占總峰面積的27.06%,但對(duì)熏雞的主體風(fēng)味成分貢獻(xiàn)很小,所以此處不做詳細(xì)分析。其他組分均為潛在的嗅感物質(zhì),共有40種(表7),醛類化合物(7種,占34.89%)、不飽和烴類化合物(12種,占17.47%)、醇類化合物(3種,占7.4%)、酚類化合物(5種,占5.64%)、醚類化合物(4種,占4.86%)、酮類化合物(3種,占0.36%)、其他化合物(6種,占2.65%)。

表7 熏雞風(fēng)味成分(n=3)Table 7 Flavor compounds in smoked chicken(n=3)

依據(jù)ROAV理論[9],溝幫子熏雞的主體風(fēng)味成分有如下8種(ROAV≥1):二甲基二硫醚、己醛、檸檬烯、壬醛、芳樟醇、糠醛、庚醛、2-戊基呋喃。同時(shí),5-甲基呋喃醛、茴香腦、草蒿腦、丁香酚、α-側(cè)柏烯、γ-萜品烯、4-萜品醇也可能對(duì)溝幫子熏雞總體風(fēng)味具有重要作用(0.1≤ROAV<1)。

檢出的烴類化合物中,萜烯類對(duì)溝幫子熏雞風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,可能與熏雞煮制過(guò)程中,加入多種香辛料有關(guān)[14]。如檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣、柑橘味道,存在于橙子、胡椒等多種精油中;萜品烯具有令人愉悅的花香、木香,對(duì)熏雞風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)。

醇類物質(zhì)主要來(lái)源于不飽和脂質(zhì)的氧化降解[19],一般來(lái)說(shuō),一級(jí)飽和脂肪醇閾值較高,對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較小,不飽和醇的閾值相對(duì)較低,對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。如芳樟醇具有清風(fēng)香味,可能來(lái)自于熏雞煮制時(shí)添加的丁香、陳皮、白芷、良姜等香辛料中[20],而4-萜品醇和α-松油醇主要來(lái)自于香辛料肉桂、丁香和八角茴香[7]。

醛是雞肉脂肪受熱時(shí)的特征香味物質(zhì)[21],而直鏈醛一般源于油脂氧化[22]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出8種醛類,其中己醛、庚醛、壬醛可能是來(lái)自于熏雞加工過(guò)程中不飽和脂肪酸的氧化降解。己醛呈現(xiàn)清香青草氣味,庚醛具有強(qiáng)烈而不愉快的、粗糙刺鼻的油脂氣味,壬醛具有類似牛脂的氣息[23]。糠醛是溝幫子熏雞中是重要的特征性醛類物質(zhì),其含量最高(20.65%)且閾值較低。糠醛由溝幫子熏雞在熏制過(guò)程中蔗糖熱解產(chǎn)生[24],這也是其含量最高的原因,并與劉君等[25]利用糖熏工藝熏制雞肉的結(jié)果一致。糠醛可使產(chǎn)品具有木香、焦糖香和烘烤食品的香味[24],并且對(duì)煙熏氣味的形成有一定作用[26]。此外,肉桂醛及反式肉桂醛則可能是在溝幫子熏雞煮制過(guò)程中添加香辛料肉桂而引入的物質(zhì)[27-28]。

酚類物質(zhì)呈現(xiàn)出一種清香的氣味,是煙熏產(chǎn)品的特色揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[26]。共鑒定出酚類物質(zhì)5種且相對(duì)含量為5.64%,其中乙基麥芽酚含量最高,來(lái)源是在熏雞加工過(guò)程中作為添加劑被加入,乙基麥芽酚具有增香增甜的作用,無(wú)煙熏特色風(fēng)味。丁香酚有一定的煙熏氣味,主要來(lái)自于熏雞煮制過(guò)程中添加的丁香葉[20]。2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、甲基丁香酚、間甲酚可能來(lái)自于糖熏過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng),都具有煙熏特色風(fēng)味對(duì)熏雞煙熏風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

此外本實(shí)驗(yàn)還檢出一定含量的酮類、酸類、酯類、胺、醚、呋喃等物質(zhì),也對(duì)溝幫子熏雞風(fēng)味形成產(chǎn)生一定的作用。茴香腦和草蒿腦可能與煮制時(shí)加入的八角茴香等香辛料有關(guān),它們對(duì)溝幫子熏雞特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大[20,29]。二甲基二硫醚則有強(qiáng)烈的洋蔥、大蒜氣味,對(duì)于熏雞獨(dú)特風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)。呋喃類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物,其中2-戊基呋喃主要源于亞油酸及2-癸二烯醛氧化[30],是熏雞的主要風(fēng)味成分,2-乙?；秽尸F(xiàn)甜香以及青香味,在溝幫子熏雞風(fēng)味中起著協(xié)調(diào)、平衡的作用。

本實(shí)驗(yàn)借助相對(duì)氣味活度值(ROAV),對(duì)溝幫子熏雞各風(fēng)味成分的實(shí)際貢獻(xiàn)程度進(jìn)行分析評(píng)價(jià),確定溝幫子熏雞的主體風(fēng)味成分,但由于部分揮發(fā)性物質(zhì)閾值未在以往文獻(xiàn)中查閱到,因而未做分析。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)固相微萃取針進(jìn)行篩選,找出適合固相微萃取的最佳萃取針為CAR/PDMS(75 μm),確定熏雞風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)條件為樣品質(zhì)量4.0 g/20 mL樣品瓶、預(yù)熱溫度50 ℃、預(yù)熱時(shí)間10 min、萃取溫度55 ℃、萃取時(shí)間45 min、解吸溫度240 ℃、解吸時(shí)間4 min。該檢測(cè)條件下分析得到72種風(fēng)味成分,烴類26種、醇類7種、醛類8種、酮類3種、酸類7種、酯類5種、酚類5種、醚類4種及其它化合物7種。其中,溝幫子熏雞的主體風(fēng)味成分為二甲基二硫醚、己醛、檸檬烯、壬醛、芳樟醇、糠醛、庚醛、2-戊基呋喃;5-甲基呋喃醛、茴香腦、草蒿腦、丁香酚、α-側(cè)柏烯、γ-萜品烯、4-萜品醇也可能對(duì)溝幫子熏雞總體風(fēng)味具有重要作用。

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