馬慧娟,徐 慧,李俐俐,劉 姝,賈 濤,李新麗,高 宏,張厚森

(江蘇省理化測試中心,江蘇南京 210046)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)是唯一能引起人畜共患病的主要致病菌,由于該菌具有耐高鹽、高滲透壓、低溫和低水分的特點(diǎn),因此其可在極端條件下生長且很難在食物鏈中被清除[1]。2002年,LM已被 WHO 列為四大重要的食源性致病菌之一[2]。據(jù)報(bào)道,近年來由LM引發(fā)的病例呈上升趨勢[3-6],且由該菌感染引起的食物中毒導(dǎo)致的人畜患胃腸炎、腦膜炎、敗血癥以及流產(chǎn)和死胎等疾病的死亡率高達(dá)30%～70%[7-8]。隨著人們生活節(jié)奏的加快,冷藏、速凍食品的消費(fèi)量也迅速增加,但該類食品被LM感染會(huì)持續(xù)腐敗[9],因此冷藏類食品的微生物檢測必須引起重視。

目前,國內(nèi)外對LM的檢驗(yàn)方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測和快速檢測兩大類,前者包括國際上的FDA-BAM、ISO 11290 等方法[10]。我國常用的是國標(biāo)法,自1994年(GB/T4789.30-1994)發(fā)布以來一直作為食品衛(wèi)生中LM檢測的主要依據(jù),截止2017年該法已進(jìn)行了4次修訂(GB/T4789.30-2003、GB/T 4789.30-2008、GB 4789.30-2010和GB 4789.30-2016),其中,與GB 4789.30-2010相比,GB 4789.30-2016《單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》增加了“第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法”和“第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN 計(jì)數(shù)法”,進(jìn)一步滿足了LM的計(jì)數(shù)要求,并且方法的可操作性得到很大提升,有利于基礎(chǔ)條件相對薄弱的實(shí)驗(yàn)室開展檢測。快速檢測法包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)和側(cè)流免疫法(Lateral Flow Immunoassay)等免疫學(xué)方法、生物傳感器法、基于噬菌體的檢測法及多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、核酸探針雜交技術(shù)和恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等分子生物學(xué)方法[11]。與傳統(tǒng)的檢測方法相比,免疫學(xué)方法具有速度快、可重復(fù)性好;生物傳感器法響應(yīng)時(shí)間慢,壽命短且靈敏度不高;而分子生物學(xué)方法檢測快速、可重復(fù)性強(qiáng)、且可同時(shí)設(shè)置多參數(shù)檢測,并能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化,但快速檢測方法存在特異性低、檢測結(jié)果假陽性率偏高、成本高等缺點(diǎn),因此在食品衛(wèi)生微生物的實(shí)際檢驗(yàn)中,各單位部門和食品檢測中心仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法為主。

本研究通過比較平板計(jì)數(shù)(Plate counting)法和稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)(Most probable number counting,MPN)法測定人工污染不同雜菌和LM的不同種類食品中LM的檢出率而篩選出最佳檢測方法,并比較不同食品在不同儲(chǔ)存條件下LM的數(shù)量，進(jìn)而探討食品冰箱保存的最佳保存時(shí)間和方法,為家庭冰箱食品的保存條件提供參考性的建議。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

牛奶、涼拌菜和鹽水鴨 采自南京市某超市,采集當(dāng)天進(jìn)行樣品檢測；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CICC21633和金黃色葡萄球菌(StaphylococcusAureus,SA)CICC21600 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)25922 廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究中心。

拍擊式均質(zhì)器 HBM-400B中國天津;李氏增菌肉湯(LB肉湯，批號：3105131)、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(批號：6103134)、李氏增菌液LB1(批號：6105150)、LB2配套試劑(批號：6105236)、PALCAM 瓊脂(批號：3104527)、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE，批號：3105514)、LM生化鑒定試劑盒(批號：5105133) 廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試樣的制備及檢測 將從南京市某超市采集的牛奶、涼拌菜和鹽水鴨樣品當(dāng)天立即按照GB 4789.30-2016中的第一法進(jìn)行定性檢測,檢測結(jié)果為LM陰性。樣品的平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法采用GB 4789.30-2016 中的第二法和第三法[13]。

1.2.2 菌種數(shù)量的獲取 將LM、E.coli和SA分別接種于營養(yǎng)肉湯中,其中E.coli和SA混合接種于一份營養(yǎng)肉湯中,(36±1) ℃培養(yǎng)24 h;取1 mL菌液與9 mL的生理鹽水混勻,10倍倍比稀釋,進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[12],計(jì)數(shù)方法同GB 4789.2-2016[14]。

1.2.3 模擬雜菌含量低污染試樣的檢測 取LM檢測均為陰性的牛奶、涼拌菜(在無菌條件下剪碎)和鹽水鴨(在無菌條件下剪碎)試樣,于沸水中煮10 min,每個(gè)樣品分為平行4份,3份接種菌液,根據(jù)菌液濃度取不同的量分別加入含有25 mL牛奶、25 g涼拌菜和25 g鹽水鴨的225 mL的LB肉湯中,使LM的終濃度分別約為600、100和20 CFU/mL,同時(shí)使E.coli和SA的數(shù)量之和分別約為60、10和2 CFU/mL,使目標(biāo)菌(LM)和雜菌(E.coli和SA)數(shù)量比例約為10∶1,另1份不接菌,作為陰性對照。每個(gè)濃度做3個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

上述目標(biāo)菌和雜菌的數(shù)量均為在做樣品的同時(shí)取一定量的樣品進(jìn)行平板計(jì)數(shù)的結(jié)果,即取每個(gè)濃度的樣品25 g(mL)分別加入225 mL LB增菌液和無菌生理鹽水中,按照GB 4789.30-2010(第二法)、GB 4789.3-2016(第二法)[15]和GB 4789.10-2016(第二法)[16]分別做平板計(jì)數(shù),計(jì)算LM、E.coli和SA的具體數(shù)量。

1.2.4 模擬雜菌含量高污染試樣的檢測 取LM檢測均為陰性的牛奶、涼拌菜(在無菌條件下剪碎)和鹽水鴨(在無菌條件下剪碎)試樣,在沸水中煮10 min,每個(gè)樣品分為平行4份,3份接種菌液,根據(jù)菌液濃度取不同的量分別加入含有 25 mL牛奶、25 g涼拌菜和25 g鹽水鴨的225 mL的LB肉湯中,使LM的終濃度分別約為600、100和20 CFU/mL,同時(shí)使E.coli和SA的數(shù)量之和分別約為6000、1000和200 CFU/mL,使目標(biāo)菌(LM)和雜菌(E.coli和SA)數(shù)量比例約為1∶10,另1份不接菌,作為陰性對照。每個(gè)濃度做3個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。加目標(biāo)菌和雜菌的數(shù)量計(jì)算方法同1.2.3。

1.2.5 冷凍和冷藏保藏污染試樣的檢測 取若干滴LM菌液加入牛奶、涼拌菜和鹽水鴨中,混勻,分成2份,分別置于2～8 ℃和-20 ℃的冰箱中保存,取保存3、5、7 d的樣品用MPN計(jì)數(shù)法進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2003軟件建立數(shù)據(jù)庫,運(yùn)用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無雜菌的染菌實(shí)驗(yàn)

無雜菌的不同食品染菌試樣檢測結(jié)果見表1,牛奶、涼拌菜和鹽水鴨試樣的染菌實(shí)驗(yàn)表明,平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法測得的LM結(jié)果均接近于染菌的起始濃度。結(jié)果相差不超過0.5倍,結(jié)果均小于1個(gè)數(shù)量級。不同種類食品不同染菌量平板計(jì)數(shù)法測得的LM結(jié)果是初始染菌量的0～0.05倍,MPN計(jì)數(shù)法測得的LM結(jié)果是初始染菌量的0～0.5倍,在無雜菌污染時(shí),平板計(jì)數(shù)法比MPN計(jì)數(shù)法的準(zhǔn)確度更高一些。

表1 無雜菌的不同食品染菌實(shí)驗(yàn)中LM的檢測結(jié)果Table 1 Detection results of LM in different foods contamination tests with non content of miscellaneous bacterium

2.2 雜菌含量低的染菌實(shí)驗(yàn)

模擬雜菌含量低的試樣檢測結(jié)果見表2,牛奶、涼拌菜和鹽水鴨試樣的染菌實(shí)驗(yàn)表明,平板計(jì)數(shù)法測得的LM結(jié)果接近于染菌的起始濃度,結(jié)果相差0.6～1.2倍,小于1個(gè)數(shù)量級,其中鹽水鴨試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度最接近,結(jié)果最高相差1.1倍;涼拌菜試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差0.9～1.1倍;牛奶試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差最大,結(jié)果相差0.6～1.2倍,試樣除鹽水鴨外,結(jié)果表明,LM染菌濃度越小(<100 CFU/g(mL)),檢測菌量與染菌量的結(jié)果相差越大。MPN計(jì)數(shù)法檢測LM結(jié)果遠(yuǎn)高于染菌的起始濃度,結(jié)果相差1.2～18倍,其中鹽水鴨試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差最大,結(jié)果相差2.2～18倍;涼拌菜試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差最小,結(jié)果相差1.2～3.9倍;牛奶試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差2.2～7.5倍;所有試樣檢測結(jié)果表明LM染菌濃度越小(<100 CFU/g(mL)),檢測菌量結(jié)果與染菌量的結(jié)果相差越小。

表2 雜菌含量低的不同食品染菌實(shí)驗(yàn)中LM的檢測結(jié)果Table 2 Detection results of LM in different foods contamination tests with low content of miscellaneous bacterium

2.3 雜菌含量高的染菌實(shí)驗(yàn)

模擬雜菌含量高的試樣檢測結(jié)果見表3。牛奶、涼拌菜和鹽水鴨試樣的染菌實(shí)驗(yàn)表明,平板計(jì)數(shù)法檢測LM結(jié)果遠(yuǎn)低于染菌的起始濃度,結(jié)果相差0.5～0.8倍,與雜菌含量低的平板計(jì)數(shù)法測得的0.6～1.2倍相比,測量結(jié)果的準(zhǔn)確性略有降低。其中涼拌菜試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差最大,結(jié)果相差0.5～0.8倍;鹽水鴨和牛奶試樣測得的結(jié)果與染菌的起始濃度相差相對較小,結(jié)果相差0.6～0.8倍;且LM染菌的初始濃度越高(≥100 CFU/g(mL)),檢測菌量與初始濃度相差越小。MPN計(jì)數(shù)法測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相比,結(jié)果相差1.1～2.5倍,與雜菌含量低的MPN計(jì)數(shù)法測得的1.2～18倍相比,測量結(jié)果的準(zhǔn)確性提高約7倍。其中鹽水鴨試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度最接近,結(jié)果相差1.1～2.0倍;涼拌菜試樣測得的LM結(jié)果與染菌的起始濃度相差1.4～1.8倍;牛奶試樣測得的結(jié)果與染菌的起始濃度相差最大,結(jié)果相差1.5～2.5倍,且LM染菌的初始濃度越高(≥100 CFU/g(mL)),結(jié)果相差越大。

2.4 冷藏前后試樣中單增李斯特氏菌數(shù)量的變化

由表4結(jié)果可知,2～8 ℃保存后的3種試樣中LM的數(shù)量隨著保存時(shí)間的增加均有不同程度的增加。牛奶樣在保存3 d后LM的數(shù)量增長最多,比初始結(jié)果增加了4倍,之后增長速度減慢,7 d時(shí)增加了10.6倍;涼拌菜中的增長速度最慢,保存3、5 和7 d的LM數(shù)量分別增加了1.3、2.1和3.2倍;鹽水鴨中的LM增長速度最快,3 d增加了2.6倍,5 d時(shí)增長量與牛奶中的相同,增加了6.4倍,7 d時(shí)的增長量為初始菌量的26倍。牛奶、涼拌菜和鹽水鴨在經(jīng)過不同冷藏保存時(shí)間后LM數(shù)量對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。由于涼拌菜的初始染菌量與牛奶和鹽水鴨不同,無法比較經(jīng)過相同保存天數(shù)后的不同種類食品中LM數(shù)量增長是否有差異,但根據(jù)表4結(jié)果可知,LM的增長速度:涼拌菜<牛奶<鹽水鴨。

表4 冷藏保存時(shí)間對LM數(shù)量變化的影響Table 4 The effect of storage time on the variation of LM

2.5 冷凍前后試樣中單增李斯特氏菌數(shù)量的變化

表5結(jié)果顯示-20 ℃保存后的試樣中LM的數(shù)量均有不同程度的增加。牛奶和涼拌菜冷凍3 d后,LM的數(shù)量與初始量相比無變化或變化很小,數(shù)量差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),而鹽水鴨中的LM數(shù)量增加了3倍,與初始對比差異顯著(p<0.05)。冷凍保藏過程中,LM的數(shù)量在涼拌菜中的增長速度最慢,而鹽水鴨中LM的數(shù)量增長最快;牛奶、涼拌菜和鹽水鴨中LM數(shù)量在5 d時(shí)分別增長了11.9、3.2和11.9倍,而7 d時(shí)增長量分別為25.8、10.4和42倍,三種食品的LM數(shù)量在3與5、5與7 d及分別與初始水平相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

三種食品分別在冷藏和冷凍條件下保存到7 d時(shí),LM的數(shù)量均大幅度增加,尤其是鹽水鴨中的增長量最大,推測熟肉中的蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)含量高而有利于LM的生長。由于涼拌菜的初始染菌量與牛奶和鹽水鴨不同,無法比較不同種類的食品在同樣的保存天數(shù)LM數(shù)量增長是否有差異,但由表5中的結(jié)果可知,LM增長的速度:涼拌菜<牛奶<鹽水鴨,與冷藏條件下LM食品種類增長一致。

表5 冷凍保存時(shí)間對LM數(shù)量變化的影響Table 5 The effect on the variation of LM with time of forzen storage

3 結(jié)論

本文研究結(jié)果對比表明,在LM污染水平較高(≥100 CFU/g(mL))，雜菌含量低(LM含量與雜菌含量比為10∶1)的情況下，平板計(jì)數(shù)法優(yōu)于MPN計(jì)數(shù)法,因此對食品中LM的定量檢測較為適用,而在LM污染水平較低(<100 CFU/g(mL))雜菌含量高(LM含量與雜菌含量比為1∶10)的情況下,由于平板計(jì)數(shù)法沒有前增菌和選擇性增菌步驟,雜菌會(huì)嚴(yán)重干擾可疑LM菌落的識別和鑒定,不能準(zhǔn)確進(jìn)行LM的計(jì)數(shù)。在選擇不同的檢測方法時(shí),如不能對食品中LM的數(shù)量進(jìn)行把握,可同時(shí)進(jìn)行兩種定量檢測方法檢測,以期提高樣品中LM檢測的準(zhǔn)確性。食品中LM數(shù)量隨冷藏和冷凍保存時(shí)間的增加而增多,且保存3、5、7 d的同種食品中菌數(shù)對比差異顯著(p<0.05),因此冷藏或冷凍于冰箱的食品應(yīng)縮短存儲(chǔ)時(shí)間而盡快食用,減少“冰箱病”的發(fā)生率。

[1]段霞,黃欣,黃嶺芳,等. 雙抗夾心ELISA方法檢測食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[J]. 食品科學(xué),2010,31(24):272-276.

[2]駱學(xué)農(nóng),曹曉瑜,才學(xué)鵬. 李氏桿菌研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(1):28-31.

[3]郭崇健,張?zhí)m榮,高翔,等.2例單核細(xì)胞增生李斯特菌病人的病原學(xué)分析[J]. 中國衛(wèi)生檢志,2015,25(3):356-357.

[4]馮延芳,冉陸,張立實(shí). 2000-2009年中國李斯特菌病文獻(xiàn)報(bào)告病析[J]. 疾病檢測,2011,22(8):654-659.

[5]楊洋,付草,郭云昌,等. 2005 年中國食源性單核細(xì)胞李斯特菌耐藥性分析[J]. 衛(wèi)生研究,2008,37(2):183-186.

[6]阮明捷,游川,李書明,等. 1例單核細(xì)胞增生李斯特菌感染引起孕婦的雙胎死亡的調(diào)查報(bào)告[J]. 性病學(xué)雜志，2015，16(3):353-354.

[7]Kerr NG,Lacey RW. Listeriosis:new problems with an old pathogen[J]. J of Hospital Infention,1988(12):247.

[8]沈曉盛,鄭國興,李慶,等. 食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的危害及其檢測[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè) 2004,30(8):87-91.

[9]金偉平,黃志強(qiáng),劉群群,等. 頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析單增李斯特菌污染冷藏牛肉的揮發(fā)性物質(zhì)[J]. 食品科學(xué),2012,33(2):243-247.

[10]Law WF,Ab Mutalib NS,Chan KG,et al. An insight into the isolation,enumeration,and molecular detection ofListeriamonocytogenesin food[J]. Front Microbiology,2015(6):1227.

[11]李云霞,陳雯雯,顧晨榮,等. 單增李斯特菌的檢測方法研究進(jìn)展[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2015,44(6):687-693.

[12]郭倩倩. 多重PCR技術(shù)和重組DNA技術(shù)在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用[D]. 上海：上海海洋大學(xué),2010.

[13]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 4789.30-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測定[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[15]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 4789.3-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-大腸菌群計(jì)數(shù)[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[16]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.