俞建峰 - 夏曉露 - 崔政偉 - 陳 健 張楚唯 -

(1. 江南大學(xué)機械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進制造裝備技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

隨著消費者食品安全意識的不斷提高，以及食品相關(guān)法律法規(guī)執(zhí)行力的逐步增強，食品安全和食品質(zhì)量正受到越來越多的關(guān)注。而在食品安全領(lǐng)域最讓消費者關(guān)注的就是細菌、寄生蟲和病毒這類能夠引起食源性疾病的病原體[1-2]。滅菌是最有效的食品保鮮方法之一，已被廣泛地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。如今，傳統(tǒng)的熱滅菌技術(shù)在食品工業(yè)中依然占主導(dǎo)地位，但也存在缺陷。為了克服熱滅菌的局限性，目前的研究重點在于開發(fā)新的滅菌技術(shù)[3]。不同的非熱滅菌技術(shù)(如超高壓[4]、超聲波[5]、高壓脈沖電場[6]、電子束輻照[7]等)都已被證實具有良好的滅菌效果。

近來，發(fā)光二極管(LED)技術(shù)成為微生物滅活方面的研究熱點。LED是一種可以在非常窄的波長光譜內(nèi)發(fā)光的半導(dǎo)體組件。與傳統(tǒng)的可見光源相比，其具備能耗低、耐用性高等優(yōu)點。此外，由于體積較小，LED可靈活應(yīng)用于現(xiàn)有系統(tǒng)[8-9]。如今，LED已廣泛應(yīng)用于光電、電子和醫(yī)療等領(lǐng)域。多項研究[10-11]表明，使用LED藍光處理懸浮狀態(tài)下食源性病原體，可使其降低多個數(shù)量級。

檸檬酸是一種動植物體內(nèi)重要且常見的有機酸，安全無毒、無害，常在食品領(lǐng)域被作為食品添加劑和防腐劑使用[12]。檸檬酸能夠降低環(huán)境的pH，使氫離子在細胞內(nèi)不斷累積，從而改變細胞內(nèi)的滲透壓，破壞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，故具備抑制細菌細胞生長和繁殖的功能[13-14]。

大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)是一種常見的食源性致病菌，可產(chǎn)生志賀毒素，引起出血性腸炎、溶血性尿毒癥綜合征等[15]。疾病控制和預(yù)防中心(CDC)的報告稱，每年由大腸桿菌O157:H7引起的食源性感染約有73 000 例，其中有2%～7%為嚴重的溶血性尿毒癥綜合征[16]。大腸桿菌O157:H7的食源性致病爆發(fā)主要與受污染的食物(如新鮮蔬菜、酸性飲料和肉類等)有關(guān)[17]。目前，關(guān)于LED可見光抗菌的研究方向主要有可見光波長、不同的食物基質(zhì)和不同的食源性致病菌等，而針對LED藍光輻照強度與檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7的協(xié)同抗菌的研究尚未見報道。本試驗主要研究不同輻照強度的LED藍光以及不同質(zhì)量濃度的檸檬酸與LED藍光協(xié)同作用對大腸桿菌O157:H7抗菌效果的影響，以期為食品加工生產(chǎn)和食品保鮮中大腸桿菌O157:H7的滅活提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157:H7 (EscherichiacoliO157:H7) 菌株：江南大學(xué)生物工程學(xué)院微生物實驗室；

檸檬酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：1 g葡萄糖，15 g瓊脂，5 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸出粉，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，錐形瓶分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，3 g牛肉浸出粉，5 g氯化鈉，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，錐形瓶分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；

精密電子分析天平：AR1140型，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；

恒溫鼓風(fēng)烘干干燥箱：DHG-9076A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

超凈工作臺：SJ-CJ-2FD型，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：XFS-280型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；

恒溫生化培養(yǎng)箱：SPX-200型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；

藍光LED燈：TDB-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化及懸菌液制備 將甘油管保藏的菌種從-20 ℃的冰箱中取出，放在超凈工作臺上，室溫融化，用滅菌后的接種環(huán)取1環(huán)菌液在固體瓊脂培養(yǎng)基上進行平板劃線，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h。挑取培養(yǎng)基上生長旺盛的單菌落，接種于液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩搖床培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)2～3次。將初始菌液10倍系列稀釋，并用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，然后計算其濃度?；罨玫木嘿A存于4 ℃的冰箱中，且時間不超過10 d。

1.2.2 LED光照系統(tǒng) 藍光LED燈具功率為9 W，光照直徑為90 mm。在光照試驗中，光源與培養(yǎng)皿的間距分別為4.5，5.5，6.5 cm，其對應(yīng)輻照強度為141.4，85.8，26.7 mW/cm2。將安裝好的LED燈具固定于燈架上，且整個LED光源放置于含有內(nèi)接電源的恒溫控制培養(yǎng)箱中，LED光照系統(tǒng)截面示意圖見圖1。

1. 懸菌液 2. 燈架 3. 散熱板 4. 恒溫生化培養(yǎng)箱 5. 藍光LED 6. 藍光 7. 培養(yǎng)皿 8. 聚四氟乙烯板

圖1 LED光照系統(tǒng)截面示意圖

Figure 1 The cross sectional diagram of the LED illumination system

1.2.3 LED藍光對大腸桿菌O157:H7的抗菌試驗 為模擬超市貨架低溫及室溫，將試驗溫度設(shè)計為12，25 ℃。在超凈工作臺上，使用無菌去離子水，將初始大腸桿菌O157:H7菌液10倍系列稀釋至107CFU/mL。而后用移液管將1 mL大腸桿菌O157:H7菌液移至9 mL的營養(yǎng)肉湯中，以模擬食物基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)。將菌懸液置于LED光照系統(tǒng)下的無菌培養(yǎng)皿(D=60 mm)中。分別在12，25 ℃條件下，調(diào)節(jié)培養(yǎng)皿與LED光源間距分別為4.5，5.5，6.5 cm，采用LED藍光照射8 h，同時在沒有LED光照的情況下使用相同的裝置進行對照試驗，每間隔1 h取樣一次。參照Min-Jeong Kim等[18]的方法，按式(1)計算每個細菌受到的光照劑量。

E=Pt，

(1)

式中：

E——光照劑量，J/cm2；

P——輻照強度，mW/cm2；

t——光照時間，s。

1.2.4 檸檬酸對大腸桿菌O157:H7的抗菌試驗 根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》，本試驗中擬定的檸檬酸質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg。制備檸檬酸溶液：分別取0.2，0.5，1.0 g檸檬酸，溶解于1 000 g去離子水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；檸檬酸對大腸桿菌O157:H7生長影響試驗：在超凈工作臺上，使用無菌去離子水，將初始大腸桿菌O157:H7菌液10倍系列稀釋至107CFU/mL，然后用移液管將1 mL大腸桿菌O157:H7菌液移至9 mL的營養(yǎng)肉湯中，再分別加入質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg的檸檬酸，空白對照組加入等量的無菌去離子水。試驗懸菌液放置于無菌培養(yǎng)皿中，分別在溫度為12，25 ℃，且無光照條件下自然生長8 h，每間隔1 h取樣一次。

1.2.5 LED藍光與檸檬酸溶液的協(xié)同抗菌試驗 在超凈工作臺上，使用無菌去離子水，將初始大腸桿菌O157:H7菌液10倍系列稀釋至107CFU/mL，然后用移液管將1 mL大腸桿菌O157:H7菌液移至9 mL的營養(yǎng)肉湯中，再分別加入質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg的檸檬酸，空白對照組加入等量的無菌去離子水。將試驗菌懸液置于LED光照系統(tǒng)下的無菌培養(yǎng)皿中，固定培養(yǎng)皿與LED光源的間距為5.5 cm(輻照強度為85.8 mW/cm2)。分別在12，25 ℃的條件下光照8 h，每間隔1 h取樣一次。

1.2.6 菌落計數(shù)及抗菌效果的確定 在每個取樣間隔，用移液管取試驗菌液和對照菌液100 μL，然后用無菌去離子水10倍系列稀釋所取樣品，最后取200 μL稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，倒入平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。在37 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，然后進行人工菌落計數(shù)?！翱咕Ч睘閷φ战M(CK)與試驗組(CM)的試驗結(jié)果差異。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 根據(jù)3次獨立試驗的試驗數(shù)據(jù)，計算平均值。采用SAS 8.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計算平均值±標準偏差及顯著性分析。以試驗時間為橫坐標，菌落總數(shù)為縱坐標，利用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LED輻照強度對大腸桿菌O157:H7抗菌效果的影響

細菌細胞中含有光敏物質(zhì)——卟啉，它們能夠吸收電磁光譜中特定波長的可見光。卟啉吸收光子后轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，在從激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛鶓B(tài)的過程中將能量釋放給不能吸收光子的氧化物，促使其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(ROS)。產(chǎn)生的活性氧包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等，這些活性氧物質(zhì)通過細胞毒性方式與各種細胞成分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等進行反應(yīng)并最終導(dǎo)致細胞死亡[19]。LED光照破壞細胞的機理見圖2。

Bg. 基態(tài)卟啉 Be. 激發(fā)態(tài)卟啉 O. 氧化物 ROS. 活性氧圖2 細胞光敏化破壞的機理Figure 2 Mechanism of destructive action of photosensitization in the cell

由圖3可知，12 ℃時對照組中的大腸桿菌O157:H7數(shù)量變化并不明顯(P>0.05)。說明在12 ℃下，大腸桿菌O157:H7的細胞活性較低，生長速率緩慢。在使用3種不同輻照強度的LED藍光照射8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05)。輻照強度為141.4 mW/cm2的光照抗菌效果最好，曲線下降趨勢最快(P<0.05)，在試驗8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量相對于對照組減少了(2.60±0.19) lg CFU/mL。而在26.7，85.8 mW/cm2的輻照強度下光照8 h后大腸桿菌O157:H7 的數(shù)量相對于對照組僅減少了(1.17±0.13)，(1.87±0.08) lg CFU/mL。同時可觀察到，抗菌效果隨著輻照強度的增加而增強。

圖3 12 ℃下輻照強度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 3 Effects of irradiation intensity on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 12 ℃

由圖4可知，25 ℃時對照組中的大腸桿菌O157:H7數(shù)量呈不斷上升趨勢(P<0.05)，在8 h后增長至(8.16±0.16) lg CFU/mL。這表示在25 ℃下大腸桿菌O157:H7的細胞活性較強，生長速率較快。不難發(fā)現(xiàn)，在26.7 mW/cm2的輻照強度下光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量仍然呈現(xiàn)上升趨勢(P<0.05)，與對照組相比其數(shù)量減少了(1.11±0.10) lg CFU/mL，說明在該輻照強度下，LED光照僅表現(xiàn)為減緩其生長速率的作用。而使用輻照強度為141.4 mW/cm2LED藍光照射，其抑菌效果最好，在光照劑量達到4 072.3 J/cm2后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量相對于對照組減少了(2.82±0.10) lg CFU/mL。結(jié)合圖3和圖4可得出，無論溫度如何，LED輻照強度對于營養(yǎng)肉湯中的大腸桿菌O157:H7抗菌效果均有較大的影響。但在室溫下LED光照對大腸桿菌O157:H7細胞數(shù)量的控制不如低溫下的明顯，其原因可能是在低溫環(huán)境下，細胞內(nèi)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的酶活性降低，導(dǎo)致活性氧無法被及時清除。另一種可能的解釋是在低溫條件下，細胞的細胞膜流動性減弱，從而抑制細胞的能量代謝，導(dǎo)致細胞對LED光照更加敏感[20]。

圖4 25 ℃下輻照強度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 4 Effects of irradiation intensity on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 25 ℃

2.2 檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7抗菌效果的影響

由圖5可知，對照組中大腸桿菌O157:H7的數(shù)量變化趨勢較平緩(P>0.05)，培養(yǎng)8 h后僅增加了(0.04±0.02) lg CFU/mL。在試驗組中添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg 的檸檬酸培養(yǎng)8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量與對照組相比分別減少了(0.07±0.02)，(0.15±0.01)，(0.24±0.03) lg CFU/mL。結(jié)果表明，在低溫下，質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg 的檸檬酸對于大腸桿菌O157:H7的生長影響較小。

圖5 12 ℃下檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 5 Effects of the mass concentration of citric acid on on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 12 ℃

由圖6可知，在室溫下對照組中大腸桿菌O157:H7的數(shù)量顯著增多(P<0.05)，試驗8 h后迅速增長至(8.16±0.05) lg CFU/mL。同一時期在添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg 檸檬酸的試驗組中，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量分別為(7.28±0.15)，(6.91±0.09)，(6.37±0.09) lg CFU/mL，說明在室溫下營養(yǎng)肉湯中的檸檬酸可延緩大腸桿菌O157:H7 的細胞生長速率。且隨著檸檬酸質(zhì)量濃度的提高，其對大腸桿菌O157:H7的生長抑制越明顯。結(jié)合圖5和圖6發(fā)現(xiàn)，試驗中添加的3種質(zhì)量濃度的檸檬酸對于大腸桿菌O157:H7都有抑制作用，且在常溫下的抑制效果均優(yōu)于低溫環(huán)境的。檸檬酸的抑菌作用主要是其能夠穿過細菌的細胞膜，降低細胞內(nèi)pH，還能夠螯合金屬離子，并破壞細胞中蛋白質(zhì)以及細胞膜的合成系統(tǒng)。而在低溫環(huán)境下，細菌的細胞膜流動性減弱，細胞代謝能量減緩，因此，與室溫下相比，在低溫條件下檸檬酸的抑菌效果較差。

圖6 25 ℃下檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 6 Effects of the mass concentration of citric acid on on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 25 ℃

由圖7可知，12 ℃時對照組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量減少至(4.18±0.04) lg CFU/mL。而添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg檸檬酸的試驗組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量均低于對照組(P<0.05)，相對于對照組其數(shù)量分別減少了(1.72±0.08)，(2.53±0.07)，(3.30±0.14) lg CFU/mL。

圖7 12 ℃下LED光照與檸檬酸對大腸桿菌O157:H7 的協(xié)同抗菌作用

Figure 7 Synergistic antimicrobial effects of LED and citric acid onEscherichiacoliO157: H7 at 12 ℃

由圖8可知，25 ℃時對照組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量增加至(6.50±0.14) lg CFU/mL。而添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg檸檬酸的試驗組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量明顯低于對照組(P<0.05)，其數(shù)量相對于對照組分別減少了(2.40±0.19)，(2.87±0.08)，(3.57±0.24) lg CFU/mL。結(jié)合圖7可知：無論溫度如何，檸檬酸均可增強LED藍光對于大腸桿菌O157:H7的抗菌效果，兩者具有協(xié)同抗菌作用。其原因是檸檬酸可與細菌細胞壁中的Ca2+和Mg2+相結(jié)合，導(dǎo)致磷脂和脂蛋白的釋放，使細胞壁的滲透性增加，進一步惡化細胞的狀態(tài)。在LED光照期間，活性氧的主要目標是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，而檸檬酸可能通過將這些化合物暴露于活性氧中來促進LED光滅活[21]。

圖8 25 ℃下LED光照與檸檬酸對大腸桿菌O157:H7 的協(xié)同抗菌作用

Figure 8 Synergistic antimicrobial effects of LED and citric acid onEscherichiacoliO157: H7 at 25 ℃

3 結(jié)論

本研究表明，LED藍光可有效地滅活大腸桿菌O157:H7。同時食品中常用的檸檬酸，可顯著提高LED藍光對大腸桿菌O157:H7的抗菌效果。使用LED藍光照射大腸桿菌O157:H7，當(dāng)最大光照劑量為4 072.3 J/cm2時，大腸桿菌O157:H7數(shù)量能夠有效減少(2～4) lg CFU/mL。而添加檸檬酸后，當(dāng)最大光照劑量為2 471 J/cm2時，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量能夠減少(3～6) lg CFU/mL。因此，本研究在食品保鮮領(lǐng)域開辟了新方法，對于天然酸性食品如水果、蔬菜、肉類等都具有適用性。由于該方法需要的光照時間較長，因而在食品加工階段的應(yīng)用可能受到一定限制，但它有可能被用作食品的保鮮與儲藏。后續(xù)研究將進一步評估該方法對其他食源性病原體的抗菌效果以及對真實食物基質(zhì)的抗菌效果，因為細菌病原體的行為可能因生存環(huán)境中化合物的類型和含量的差異而發(fā)生變化。

[1] XUAN Weng, SURESH N. Ensuring food safety: Quality monitoring using microfluidics[J]. Trends in Food Science & Technology, 2017, 65: 10-22.

[2] SRIMAGAL A, RAMESH T, JATINDRA K S. Effect of light emitting diode treatment on inactivation ofEscherichiacoliin milk[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 71: 378-385.

[3] LI Xiang, MOHAMMED F. A review on recent development in non-conventional food sterilization technologies[J]. Journal of Food Engineering, 2016, 182: 33-45.

[4] 孫彥琳, 蘇樹朋, 韓立英, 等. 高壓CO2與超高壓均質(zhì)協(xié)同殺菌裝置的研發(fā)[J]. 食品與機械, 2017, 33(1): 84-86.

[5] 黃瑞, 余小林, 胡卓炎, 等. 超聲對荔枝汁中TAB的殺菌效果研究[J]. 食品與機械, 2014, 30(3): 214-217.

[6] AMIALI M, NGADI M O. Microbial decontamination of food by pulsed electric fields (PEFs) [J]. Microbial Decontamination in the Food Industry, 2012: 407-449.

[7] 張瑩, 朱加進. 電子束輻照技術(shù)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究[J]. 食品與機械, 2013, 29(1): 236-239.

[8] HAMAMOTO A, MORI M, TAKAHASHI A, et al. New water disinfection system using UVA light-emitting diodes[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(6): 2 291-2 298.

[9] CRAIG D, YUK H G, GEK H K, et al. Application of light-emitting diodes in food production, postharvest preservation, and microbiological food safety[J]. Food Science & Technology, 2015, 14(6): 719-740.

[10] MITCHELL D B, NATHANIEL L R P, MARTIN D L, et al. Violet 405-nm light: a novel therapeutic agent against common pathogenic bacteria[J]. Journal of Surgical Research, 2016, 206(2): 316-324.

[11] KUMAR A, GHATE V, KIM M J, et al. Inactivation and changes in metabolic profile of selected foodborne bacteria by 460 nm LED illumination[J]. Food Microbiology, 2017, 63: 12-21.

[12] 馮志合, 盧濤. 中國檸檬酸行業(yè)概況[J]. 中國食品添加劑, 2011(3): 158-163.

[13] 陳晨, 胡文忠, 何煜波, 等. Nisin和檸檬酸對純培養(yǎng)及鮮切黃瓜中單增李斯特菌的殺菌效果[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(5): 273-276.

[14] JACK A N, MAYRA M G. Comparison of multiple chemical sanitizers for reducing Salmonella andEscherichiacoliO157:H7 on spinach leaves[J]. Food Research International, 2015, 45(2): 1 123-1 128.

[15] KAHRAMAN O, LEE H, ZHANG Wei, et al. Manothermosonication (MTS) treatment of apple-carrot juice blend for inactivation ofEscherichiacoliO157:H7[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 38(4): 820-828.

[16] GHADEER A R Y, SUAIFA N, ALHOGAIL S, et al. Paper-based magnetic nanoparticle-peptide probe for rapid and quantitative colorimetric detection ofEscherichiacoliO157:H7[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2017, 92: 702-708.

[17] KIM J, KIM M, KIM S, et al. Sensitive detection of viableEscherichiacoliO157:H7 from foods using a luciferase-reporter phage phiV10lux[J]. International Journal of Food Microbiology, 2017, 254: 11-17.

[18] KIM M J, BANG W S, YUK H G. 405±5 nm light emitting diode illumination causes photodynamic inactivation of Salmonella spp. on fresh-cut papaya without deterioration[J]. Food Microbiology, 2017, 62: 124-132.

[19] ZIVILE L. New approach to inactivation of harmful and pathogenic microorganisms by photosensitization[J]. Food Techno-logy & Biotechnology, 2005, 43(4): 411-418.

[20] BEALES N. Adaptation of microorganisms to cold temperatures, weak acid preservatives, low pH, and osmotic stress: A review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science & Food Safety, 2004, 3(1): 1-20.

[21] DELVES B J. The use of EDTA to enhance the efficacy of nisin towards Gram-negative bacteria[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 1993, 32(1/2/3): 87-97.