萬玉蓮 - 陳劉順 - 謝 丹 朱益波 - 朱東興 - 齊 斌

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

苯基乳酸也稱β-苯基乳酸或2-羥基-3-苯基丙酸，有兩種對映異構(gòu)體(D-苯基乳酸以及L-苯基乳酸)，均具有抑菌性[1]，但由于空間結(jié)構(gòu)不同，兩種構(gòu)型功效有明顯差異，有研究認(rèn)為D-苯基乳酸(D-3-phenyllactic acid，D-PLA)抑菌性較L-苯基乳酸強(qiáng)[2-3]，也強(qiáng)于常用食品化學(xué)防腐劑如苯甲酸鈉、山梨酸鉀[4]，其抑菌機(jī)理是通過破壞菌體細(xì)胞壁使其裂解[2]，或改變菌體蛋白表達(dá)與代謝[5]，而對引起食品腐敗的許多霉菌[6]、酵母菌[7]，以及致病細(xì)菌具有廣譜抑制性[2,8]，比同為細(xì)菌素的乳酸鏈球菌肽(nisin)抑菌性更廣[9]，D-PLA可由益生菌——乳酸菌代謝產(chǎn)生[10]，對人體和動(dòng)物細(xì)胞無害[11-12]，作為新型廣譜安全抑菌劑，在食品防腐保鮮領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值[9]。

目前，有關(guān)苯基乳酸研究多集中在微生物合成[4，10-11，13-14]、抑菌性方面[2，5，15-16]，用于延長食品保藏期，以乳品與烤焙食品較多[9]。將D-PLA用于滅菌乳和干酪中，可使李斯特菌降低4.5個(gè)對數(shù)值[3]，也可延長全脂奶粉保質(zhì)期[17]，在面包酸面團(tuán)發(fā)酵中接種產(chǎn)苯基乳酸的不同乳酸菌菌株，可使焙烤后面包保質(zhì)期延長2～7 d不等[18-19]。相比之下其用于果蔬防腐保鮮研究較少，僅見國外在鮮切荔枝、菠蘿與柑橘保藏上的少量報(bào)道[20-21]，D-PLA用于葡萄防腐保鮮的研究至今未見報(bào)道。

葡萄采收后極易受霉菌(尤其是灰霉)侵害而產(chǎn)生腐爛和落粒，在中國南方產(chǎn)區(qū)，采收期高溫多雨更易遭病菌侵染[22]。目前葡萄貯運(yùn)中應(yīng)用較多的熏硫處理技術(shù)(即 SO2防腐劑)因存在許多安全與環(huán)保缺陷[23]，在歐美等國家已被限用[24]。因此探索鮮食葡萄無害化硫替代防腐技術(shù)勢在必行。天然食品防腐劑與可食性涂膜結(jié)合是天然食品防腐劑發(fā)展的新方向之一，國外用β-環(huán)糊精作為抗菌物緩釋被膜載體，有利于抗菌物均勻噴布與持久性作用[25]，但其用于葡萄防腐保鮮的研究至今未見報(bào)道。本研究擬用D-PLA結(jié)合β-環(huán)糊精為主劑的復(fù)配涂膜處理中國南方產(chǎn)區(qū)葡萄，研究其防腐保鮮效果，旨在為鮮食葡萄硫替代貯運(yùn)技術(shù)，探索新的生物保鮮途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

葡萄：巨峰品種，采自江蘇常熟葡萄主產(chǎn)基地，選擇顆粒大小與色澤均勻、成熟度等質(zhì)量性狀相近，無病蟲害的果實(shí)為供試材料；

D-苯基乳酸、抗壞血酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司；

β-環(huán)狀糊精、氯化鈣：食品級，市售；

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：HH-600型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

分析天平：HTP312型，上海菲克蘇工具有限公司；

均質(zhì)器：BA-2S型，上海本昂科學(xué)儀器有限公司；

菌落計(jì)數(shù)器：XK97-A型，上海海恒機(jī)電儀表有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：LDZX-75KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺：SW-CJ-2G型，蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄采后預(yù)處理 在借鑒文獻(xiàn)[20，25]及GB 2760—2011使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范基礎(chǔ)上，通過預(yù)試驗(yàn)確定采后預(yù)處理方案。將當(dāng)天采摘的葡萄及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室分為3組，每組15穗，進(jìn)行以下處理。

(1) 清水處理(CK1)：將待處理葡萄用蒸餾水浸泡5 min。

(2) 單獨(dú)涂膜處理(CK2)：將待處理葡萄用配好的普通涂膜液(含1%氯化鈣、1%β-環(huán)狀糊精、1%抗壞血酸)浸泡5 min。

(3)D-PLA結(jié)合涂膜處理(T)：將D-PLA用少量乙醇溶解后，再用配好的涂膜溶液(1%氯化鈣、1%β-環(huán)狀糊精、1%抗壞血酸)稀釋為1%苯基乳酸濃度的防腐保鮮液，將待處理葡萄浸泡5 min。

將上述3組浸泡處理后的葡萄取出自然晾干后，統(tǒng)一用市售PE食品包裝袋包裝，置室溫[(25±3) ℃]貯藏，定期取樣測定相關(guān)微生物與腐爛指標(biāo)，各組指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.2.2 測定方法

(1) 細(xì)菌菌落總數(shù)測定：按GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》執(zhí)行。

(2) 霉菌與酵母菌菌落總數(shù)測定：按GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》執(zhí)行。

(3) 大腸菌群測定：按GB 4789.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》執(zhí)行。

(4) 腐爛率測定：參照文獻(xiàn)[26]。以葡萄果實(shí)表面出現(xiàn)水漬狀病斑作為果實(shí)腐爛的判別依據(jù)，按果實(shí)腐爛面積大小將果實(shí)劃分為4級：0級，無腐爛；1級，果面有1～3個(gè)小腐爛斑點(diǎn)；2級，腐爛面積占果實(shí)面積的25%～50%；3級，腐爛面積大于果實(shí)面積的50%。按式(1)計(jì)算腐爛率。

(1)

式中：

D——每重復(fù)組腐爛率，%；

l——腐爛級別，0～3；

nl——每重復(fù)組該腐爛級別對應(yīng)的果粒數(shù)；

lmax——最高腐爛級別，3；

ntotal——每重復(fù)組總果粒數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)測定指標(biāo)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對貯藏期葡萄表面細(xì)菌數(shù)量的影響

由圖1可知，巨峰葡萄果粒表面細(xì)菌菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長而明顯增加，常溫貯藏至第10天，對照CK1組與CK2組果實(shí)表面菌落總數(shù)分別增加為貯藏首日的332倍和428.57倍，而D-PLA結(jié)合涂膜處理(T)菌落總數(shù)僅為貯藏首日的3.42倍，有效抑制了貯藏期果實(shí)表面菌落總數(shù)的增長，使處理組菌落總數(shù)在第10天低于同期CK1組99.0%(P<0.05)、CK2組99.3%(P<0.05)，在貯藏第5天低于CK1組82.5%(P<0.05)、CK2組75.7%(P<0.05)；整個(gè)常溫貯藏期，普通涂膜的CK2組較清水處理的CK1組果實(shí)表面菌落總數(shù)差異不顯著(P>0.05)，而D-PLA結(jié)合涂膜處理有效抑制了果實(shí)表面細(xì)菌菌落數(shù)的增長。

2.2 對貯藏期葡萄表面霉菌數(shù)量的影響

由圖2可知，經(jīng)D-PLA結(jié)合涂膜處理(T)顯著抑制了貯藏期果實(shí)霉菌數(shù)量的增加(P<0.05)，第5天時(shí)處理組(T)霉菌菌落總數(shù)低于CK1組90.15%(P<0.05)、CK2組96.12%(P<0.05)，第10天時(shí)處理組(T)霉菌菌落總數(shù)也顯著低于兩對照組(P<0.05)，分別較CK1與CK2組降低75.00%與94.17%。相比之下，單獨(dú)涂膜的CK2組較清水處理的CK1組有促進(jìn)果實(shí)表面霉菌總數(shù)的作用(P<0.05)，可能是與涂膜中含有利于霉菌生長的淀粉類被膜劑(β-環(huán)狀糊精)[27]有關(guān)。而本試驗(yàn)中D-PLA 結(jié)合涂膜處理(T)能有效消除這種效應(yīng)，抑制巨峰葡萄貯藏期霉菌數(shù)量的增長。

不同字母表示差異顯著，P<0.05圖1 D-PLA結(jié)合涂膜處理對葡萄貯藏期果實(shí) 表面細(xì)菌數(shù)量的影響Figure 1 Effect D-PLA combined with coating on bacterial number of table grape during storage

不同字母表示差異顯著，P<0.05圖2 D-PLA結(jié)合涂膜處理對葡萄貯藏期果實(shí)表面 霉菌數(shù)量的影響

Figure 2 Effect ofD-PLA combined with coating on mould number of table grape during storage

2.3 對貯藏期葡萄表面酵母菌數(shù)量的影響

由圖3可知，巨峰葡萄對照組果實(shí)表面酵母菌總數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長而明顯增加，D-PLA結(jié)合涂膜處理(T)組果實(shí)表面酵母菌數(shù)量隨貯藏時(shí)間的延長增加緩慢，使其始終低于中后期兩對照組(P<0.05)。第10天，對照CK1組與CK2組果實(shí)表面酵母菌總數(shù)分別增加到貯藏首日的84.21倍與61.84倍，而處理組(T)菌落總數(shù)僅為貯藏首日的1.58倍，有效抑制了貯藏期果實(shí)表面酵母菌的增加。第5天，處理組果實(shí)表面酵母菌總數(shù)較對照CK1與CK2組降低了88.57%(P<0.05)和84.91%(P<0.05)；第10天，酵母菌數(shù)量較對照CK1與CK2組降低了98.13%(P<0.05)和97.45%(P<0.05)。在兩對照組中，單獨(dú)涂膜(CK2)組較清水處理(CK1)組果實(shí)表面酵母菌總數(shù)有所降低，但差異不顯著(P>0.05)，可見D-PLA結(jié)合涂膜處理可顯著抑制巨峰葡萄貯藏期果實(shí)表面酵母菌的增長。

不同字母表示差異顯著，P<0.05圖3 D-PLA結(jié)合涂膜處理對葡萄貯藏期果實(shí)表面 酵母菌數(shù)量的影響Figure 3 Effects of D-PLA combined with coating on yeast number of table grape during storage

2.4 對貯藏期葡萄表面大腸菌群數(shù)量的影響

由表1可知，對照CK1組與CK2組的大腸菌群MPN值隨貯藏時(shí)間的延長而明顯增加，CK1組和CK2組在貯藏第5天后檢出大腸菌群陽性， MPN值均達(dá)到3.6 MPN/g，而D-PLA 結(jié)合涂膜處理組(T)在常溫貯藏期間大腸菌群的MPN值始終低于3.0 MPN/g，可見D-PLA結(jié)合涂膜處理可有效抑制巨峰葡萄常溫貯藏期果實(shí)表面大腸菌群數(shù)量的增長。

表1 貯藏期各組葡萄果實(shí)表面大腸菌群MPN值Table 1 Effect of D-PLA combined with coating on MPN of coliforms in grape

2.5 對葡萄貯藏期果實(shí)腐爛率的影響

由圖4可以看出，果實(shí)腐爛率隨貯藏時(shí)間的延長而明顯上升，至常溫貯藏末期的第10天，對照CK1組果實(shí)腐爛率較首日增加了40.7%；單獨(dú)涂膜(CK2)對果實(shí)腐爛率無抑制效果，甚至促進(jìn)了中后期腐爛率的提高，使第8天果實(shí)腐爛率高于同期清水處理(CK1)組2.2倍(P<0.05)，第10天也明顯高于同期CK1組，與2.2中促進(jìn)中后期霉菌增長結(jié)果相符，說明單獨(dú)涂膜(含淀粉類環(huán)狀糊精被膜劑)對抑制葡萄腐爛率效果不佳，甚至有后期促進(jìn)作用。相比之下，D-PLA結(jié)合涂膜處理抑制了常溫貯藏后期(6～10 d)腐爛率的上升，尤其在貯藏第10天，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，處理組(T)果實(shí)腐爛率分別較CK1和CK2組低20.65%與23.68%，果穗外觀品質(zhì)也明顯優(yōu)于兩對照組。

圖4 D-PLA結(jié)合涂膜處理對貯藏期葡萄果實(shí)腐爛率的影響Figure 4 Effect of D-PLA combined with coating on decay index of grape during storage

3 結(jié)論

微生物是導(dǎo)致果蔬采收后腐爛的主要誘因，安全高效的天然防腐劑研發(fā)是今后應(yīng)對的熱點(diǎn)策略[25]。D-PLA作為一種廣譜安全的生物防腐保鮮劑[9]，將其應(yīng)用于水果防腐保鮮的研究仍較少，本研究表明巨峰葡萄常溫貯藏期間，D-PLA結(jié)合涂膜處理顯著抑制了果實(shí)表面細(xì)菌菌落總數(shù)的增加(P<0.05)，并降低了霉菌與酵母菌數(shù)量(P<0.05)，使大腸桿菌群數(shù)量始終保持較低水平，從而降低了由這些微生物導(dǎo)致的果實(shí)貯藏中后期腐爛率的增加，與國外在荔枝[20]、菠蘿與柑橘[21]防腐保鮮上的研究結(jié)果相符。這些研究結(jié)論將有助于針對葡萄硫替代保鮮技術(shù)的苯基乳酸安全生物復(fù)合保鮮劑的研發(fā)。

已有研究[25]認(rèn)為，可食性涂膜等技術(shù)與天然食品防腐劑結(jié)合用于果蔬保鮮效果更好。 國外有用β-環(huán)糊精作為抗菌物的緩釋被膜體系[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)涂膜處理對葡萄防腐效果不及D-PLA與涂膜結(jié)合使用，甚至含β-環(huán)糊精成分的涂膜處理有促進(jìn)霉菌增長及后期果實(shí)腐爛的效應(yīng)，可能是霉菌在含淀粉類營養(yǎng)源中作用明顯[27]，這是與被膜劑中β-環(huán)狀糊精恰為淀粉類水解中間成分有關(guān)，還是與其它因素有關(guān)，值得進(jìn)一步探索。因此在保鮮劑成分的選擇上要根據(jù)產(chǎn)品劣變誘因等貯藏特性有針對性地進(jìn)行。

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