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[陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第一附屬醫(yī)院急診科，重慶400038]

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是具有高度惡性的骨原發(fā)性腫瘤，多見于兒童及青少年群體，具有起病隱匿、生長速度快、腫瘤細胞過度增殖以及遠處侵襲轉(zhuǎn)移等特點[1-2]。雖然隨著近年來醫(yī)學進步，骨肉瘤的早期診斷與治療取得了長足發(fā)展，但晚期骨肉瘤患者仍存在復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，因此深入研究骨肉瘤的異常增殖及其遠處侵襲轉(zhuǎn)移的分子作用機制對于預防晚期骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和擴散極為重要[3]。骨肉瘤作為實體瘤的一種，其異常增殖和快速生長會造成局部血供不足，不可避免地導致腫瘤局部缺氧微環(huán)境，進而對腫瘤細胞的凋亡、增殖、血管生成、分化、遠處侵襲等生物學事件產(chǎn)生影響[4]。有學者指出,Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其在骨肉瘤中也呈異常高表達[5]。但在缺氧條件下，骨肉瘤SaOS-2細胞中是否存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，以及該通路對SaOS-2細胞增殖活性和侵襲轉(zhuǎn)移的影響目前鮮有報道。本研究旨在通過模擬缺氧微環(huán)境，采用多種分子生物學方法來檢測Wnt/β-catenin信號通路的表達水平及其對骨肉瘤細胞SaOS-2增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

骨肉瘤SaOS-2細胞系購自武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心；TRIzol RNA提取試劑購自Takara公司；PCR引物的設(shè)計與合成均委托上海擎科生物科技公司制備完成；單克隆兔抗人β-catenin購自美國Abcam公司；辣根酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG購自美國Santa cruz公司；Protein marker購自Thermo Fisher公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Millipore公司；小牛血清購自GIBCO公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HYCLONE公司；RIPA組織和細胞IP裂解液及BCA法蛋白濃度測定試劑盒均購自安徽潔洋盛生物科技公司；6孔、96孔培養(yǎng)板、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶以及24孔Transwell小室(孔徑8 μm)均購自美國Corning Costar公司；專業(yè)級缺氧環(huán)境培養(yǎng)箱購自于美國Thermo Fisher生物科技公司；普光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

骨肉瘤SaOS-2細胞系在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，內(nèi)含5%CO2，培養(yǎng)細胞的DMEM培養(yǎng)基含10%小牛血清、1%濃度青鏈霉素混合液。消化重懸后的細胞種于6孔板中，待細胞鋪壁90%以上使用無血清培養(yǎng)基饑餓處理6 h后，置于低氧環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)不同時間段(8、16、24 h)，最后對SaOS-2細胞進行相應(yīng)指標的檢測。常氧培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、20%O2(常氧組)；低氧培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、1%O2(低氧組)。

1.3 CCK-8測定不同培養(yǎng)條件下的生長曲線

取生長狀態(tài)較好的第3代骨肉瘤SaOS-2細胞系進行CCK-8實驗。當細胞鋪滿達95%以上，使用胰酶消化后，依照2×104/mL的密度均勻種于96孔板中。常氧調(diào)劑和低氧調(diào)劑分別設(shè)置2個單獨96孔板，每組設(shè)置6個復孔，分別于培養(yǎng)8、16、24 h后加入20 μL CCK-8試劑進行檢測，37 ℃避光環(huán)境下孵育2～4 h后取出96孔板，隨后使用酶標儀在450 nm波長條件下檢測其吸光值(A)，以時間(d)為橫坐標，A為縱坐標繪制生長曲線。

1.4 RNA提取和Real-time PCR檢測

使用冰上預冷PBS洗滌將處理完成的細胞洗滌3次，隨后每個孔分別加入1 mL Trizol溶液，提取細胞總RNA為后續(xù)實驗做準備。PCR所用引物由上海擎科生物科技公司上海分公司合成，引物序列如下：GAPDH上游引物5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游引物5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’；β-catenin上游引物5’-GCTGCTGTTTTGTTCCGAATGT-3’，下游引物5’-GCCATTGGCTCTGTTCTGAAGA-3’。反應(yīng)條件均為：95 ℃，3 min預變性；94 ℃，30 s；48 ℃，30 s，72 ℃，1 min，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 Western blot檢測

將已處理好的骨肉瘤SaOS-2細胞系用PBS洗滌3次隨后加入RIPA裂解液并用細胞刮刀刮下來放入1.5 mL EP管中冰上裂解30 min。隨后于12 000 r/min離心10 min并將蛋白上清液凍存于-20 ℃。使用5X蛋白上樣緩沖液混勻蛋白上清后于95 ℃中加熱10 min，待其充分變性。上機跑電泳，隨后轉(zhuǎn)膜并置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。封閉結(jié)束后使用TBST洗膜5 min×3次，隨后將膜置于多克隆兔抗人的β-catenin(濃度1∶1 000)和多克隆兔抗人β-actin(濃度1∶3 000)中4 ℃孵育過夜。次日，洗膜5 min×3次后，置于辣根酶標記羊抗兔IgG中室溫孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次后，采用ECL化學發(fā)光法曝光顯影。應(yīng)用Quantity One軟件分析條帶灰度值并作統(tǒng)計分析。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

將Matrigel膠(Matrigel原液與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3)鋪在小室上面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中待用。將骨肉瘤SaOS-2細胞系在無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓處理4 h后，將其消化、重懸。上室加入無血清細胞懸液200 μL(細胞量4×105/mL)，下室加入含20%FBS的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基，每孔600 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。處理完成后取出小室，用PBS洗滌3次，并用濕棉簽輕柔擦除上室面的細胞，隨后置于4%多聚甲醛中固定20 min。取出室溫下風干3～5 min，隨后置于結(jié)晶紫染料中染色15 min。最后用PBS洗滌3次，并置于倒置顯微鏡下觀察穿過微孔膜的細胞數(shù)量，并進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 低氧對骨肉瘤SaOS-2細胞系增殖的影響

對分別進行常氧培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)的骨肉瘤SaOS-2細胞系進行細胞增殖能力檢測。CCK-8結(jié)果顯示，與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的SaOS-2細胞系的增殖能力顯著增強，而且隨著低氧培養(yǎng)時間的延長增殖效應(yīng)越顯著，但至48 h增長率有所下降(圖1)。

*：與常氧組比較，P<0.05

2.2 低氧對骨肉瘤細胞系侵襲的影響

Transwell侵襲實驗檢測結(jié)果顯示，與常氧對照組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后的骨肉瘤SaOS-2細胞系的侵襲能力顯著增強(圖2)。

2.3 低氧對Wnt/β-catenin信號通路的影響

在常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)骨肉瘤SaOS-2細胞系24 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測β-catenin的mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組SaOS-2的β-catenin mRNA和蛋白表達水平顯著升高。表明低氧能夠激活Wnt/β-catenin信號通路(圖3)。

2.4 靶向β-catenin siRNA對Wnt/β-catenin信號通路的影響

轉(zhuǎn)染β-catenin特異性siRNA及β-catenin-NC于骨肉瘤SaOS-2細胞系48 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測β-catenin mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示與β-catenin NC組和空白對照組相比，β-catenin siRNA組的β-catenin明顯下調(diào)(圖4)。

a:常氧；b:低氧；c：侵襲實驗結(jié)果統(tǒng)計分析 *：與常氧組比較，P<0.05

a：RT-PCR檢測β-catenin mRNA表達；b：Western blot檢測β-catenin蛋白表達；c：Western blot結(jié)果定量分析 *：與常氧組比較，P<0.05

圖3低氧激活骨肉瘤細胞系SaOS-2的Wnt/β-catenin信號通路

a：β-catenin si-RNA轉(zhuǎn)染熒光圖( ×200)；b：RT-PCR檢測β-catenin mRNA表達；c：Western blot檢測β-catenin蛋白表達；d：Western blot結(jié)果定量分析

圖4β-cateninsiRNA在骨肉瘤細胞系SaOS-2中有效沉默β-catenin

2.5 Wnt/β-catenin信號通路與低氧促進骨肉瘤細胞增殖相關(guān)

對分別進行常氧培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)的骨肉瘤SaOS-2細胞系進行細胞增殖能力檢測。CCK-8結(jié)果顯示，與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的SaOS-2細胞系隨著培養(yǎng)時間的延長其增殖能力顯著增強，而轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA的細胞其增殖能力顯著降低(圖5)。

2.6 Wnt/β-catenin信號通路與低氧促進骨肉瘤細胞侵襲相關(guān)

在Transwell小室遷移實驗中，我們發(fā)現(xiàn)低氧處理24 h后，與常氧對照組相比低氧轉(zhuǎn)染NC處理組中SaOS-2細胞的侵襲能力顯著增強，而轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA組的細胞侵襲能力被顯著抑制(圖6)。

圖5 靶向沉默β-catenin抑制低氧誘導的增殖

a:低氧；b:低氧+NC；c:低氧；d:低氧+β-catenin siRNA；e:侵襲實驗結(jié)果統(tǒng)計分析；f:侵襲實驗結(jié)果統(tǒng)計分析 *：與低氧組比較，P<0.05

圖6靶向沉默β-catenin減弱低氧誘導的侵襲(結(jié)晶紫染色×200)

3 討論

骨肉瘤是一種來源于骨髓間充質(zhì)的高度惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、局部生長迅速、易發(fā)生早期遠處侵襲轉(zhuǎn)移及復發(fā)等生物學特點[6-7]。骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟共同調(diào)控的結(jié)果，目前尚無有效治療方法[8]。這一問題的根本原因在于80%的骨肉瘤患者在確診時已發(fā)展到中晚期,且多已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，其中以肺部轉(zhuǎn)移最常見[9]。此外，在骨肉瘤的形成生長過程中伴隨著腫瘤細胞的異常增殖，當局部腫瘤細胞的增殖速度遠超過新生血管的生成速度時，最終將導致腫瘤實體中心部位缺乏足夠的血液供應(yīng)，形成缺血缺氧微環(huán)境[10-11]。腫瘤低氧微環(huán)境能夠通過對腫瘤細胞的增殖和侵襲產(chǎn)生影響，從而干預腫瘤發(fā)生發(fā)展的進程[12-14]。因此，深入研究低氧微環(huán)境下骨肉瘤異常增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，定有效特異性防治靶點，尋求新的干預策略對提高骨肉瘤的臨床療效具有重要意義，是治療骨肉瘤和改善臨床預后的關(guān)鍵。

Wnt/β-catenin信號通路在生物體內(nèi)細胞信息調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其參與了細胞增殖、凋亡、胚胎發(fā)育及惡性腫瘤(包括骨肉瘤)等生物學過程[15-16]。此外，β-catenin還參與了多種不同腫瘤的發(fā)病過程，主要包括：食管癌、肝癌、胃癌以及骨肉瘤等，這些研究均顯示β-catenin在這些腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達[17-20]。有研究表明，在腫瘤低氧微環(huán)境下存在Wnt/β-catenin信號通路的激活，其通過調(diào)控下游靶基因?qū)σ幌盗兄T如細胞增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學事件進行干預，最終影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21-24]。但是關(guān)于低氧微環(huán)境下Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤發(fā)病中的作用及其分子機制目前的研究尚相對較少。

在本研究中，我們首先觀察低氧微環(huán)境對骨肉瘤細胞系SaOS-2的增殖與侵襲能力的影響。結(jié)果表明，與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后SaOS-2的增殖速率顯著高于常氧組，并伴隨著侵襲能力的增強。進一步研究低氧環(huán)境下這一現(xiàn)象的分子機制，結(jié)果表明，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后SaOS-2細胞中β-catenin表達水平顯著升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路的異常激活可能參與低氧環(huán)境下骨肉瘤的異常增殖和侵襲過程。為了明確Wnt/β-catenin信號通路在其中的作用機制，我們采用β-catenin si-RNA來特異性沉默其表達，并進一步檢測β-catenin沉默對細胞增殖和侵襲的影響。結(jié)果表明，靶向沉默Wnt/β-catenin信號通路之后，低氧介導的細胞增殖和侵襲能力顯著降低，這一結(jié)果證實Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤細胞的增殖和侵襲中起著關(guān)鍵作用。因此我們認為低氧微環(huán)境下Wnt/β-catenin信號通路的激活能夠進一步調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活，從而促進骨肉瘤細胞的異常增殖和遠處侵襲轉(zhuǎn)移，最終促進骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，在缺氧模擬條件下，Wnt/β-catenin信號通路能夠顯著激活，進而來促進骨肉瘤細胞SaOS-2細胞的異常增殖并增強細胞的遠處侵襲能力，這一研究結(jié)果能夠加深對骨肉瘤發(fā)病機制的了解。因此，深入研究Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)節(jié)機制，通過靶向阻斷Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子，從而逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞的快速增殖和遠處侵襲，這對于骨肉瘤的特異性治療藥物的開發(fā)和防治具有重要意義和良好的應(yīng)用前景。

[參考文獻]

[1] Anderson ME.Update on survival in osteosarcoma[J].Orthop Clin North Am,2016,47(1):283-292.doi:10.1016/j.ocl.2015.08.022.

[2] Isakoff MS,Bielack SS,Meltzer P,et al.Osteosarcoma:current treatment and a collaborative pathway to success[J].J Clin Oncol,2015,33(27):3029-3035.doi:10.1200/JCO.2014.59.4895.

[3] Bishop MW,Janeway KA,Gorlick R.Future directions in the treatment of osteosarcoma[J].Curr Opin Pediatr,2016,28(1):26-33.doi:10.1097/MOP.0000000000000298.

[4] Gilkes DM,Semenza GL,Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:drivers of tumour metastasis[J].Nat Rev Cancer,2014,14(6):430-439.doi:10.1038/nrc3726.

[5] Vilchez V,Turcios L,Marti F,et al.Targeting Wnt/beta-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment[J].World J Gastroenterol,2016,22(2):823-832.doi:10.3748/wjg.v22.i2.823.

[6] Ottaviani G,Jaffe N.The epidemiology of osteosarcoma[J].Cancer Treat Res,2009,152:3-13.doi:10.1007/978-1-4419-0284-9_1.

[7] Picci P.Osteosarcoma(osteogenic sarcoma)[J].Orphanet J Rare Dis,2007,2:6.doi:10.1186/1750-1172-2-6.

[8] Luetke A,Meyers PA,Lewis I,et al.Osteosarcoma treatment:where do we stand?A state of the art review[J].Cancer Treat Rev,2014,40(4):523-532.doi:10.1016/j.ctrv.2013.11.006.

[9] Huang G,Nishimoto K,Yang Y,et al.Participation of the Fas/FasL signaling pathway and the lung microenvironment in the development of osteosarcoma lung metastases[J].Adv Exp Med Biol,2014,804:203-217.doi:10.1007/978-3-319-04843-7_11.

[11] Setty BA,Jin Y,Houghton PJ,et al.Hypoxic proliferation of osteosarcoma cells depends on arginase II[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(2):802-813.doi:10.1159/000447790.

[12] Liu Y,Yan W,Tohme S,et al.Hypoxia induced HMGB1 and mitochondrial DNA interactions mediate tumor growth in hepatocellular carcinoma through Toll-like receptor 9[J].J Hepatol,2015,63(1):114-121.doi:10.1016/j.jhep.2015.02.009.

[13] Zhang M,Zhang W,Wu Z,et al.Artemin is hypoxia responsive and promotes oncogenicity and increased tumor initiating capacity in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2015,7(3):3267-3282.doi:10.18632/oncotarget.6572.

[14] Silva P,Mendoza P,Rivas S,et al.Hypoxia promotes Rab5 activation,leading to tumor cell migration,invasion and metastasis[J].Oncotarget,2016,7(20):29548-29562.doi:10.18632/oncotarget.8794.

[15] Jamieson C,Sharma M,Henderson BR.Targeting the β-catenin nuclear transport pathway in cancer[J].Semin Cancer Biol,2014,27:20-29.doi:10.1016/j.semcancer.2014.04.012.

[16] Song X,Xin N,Wang W,et al.Wnt/β-catenin,an oncogenic pathway targeted by H.pylori in gastric carcinogenesis[J].Oncotarget,2015,6(34):35579-35588.doi:10.18632/oncotarget.5758.

[17] Deng F,Zhou K,Cui W,et al.Clinicopathological significance of wnt/beta-catenin signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(3):3045-3053.

[18] Cheung PF,Cheung TT,Yip CW,et al.Hepatic cancer stem cell marker granulin-epithelin precursor and β-catenin expression associate with recurrence in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(16):21644-21657.doi:10.18632/oncotarget.7803.

[19] Yong X,Tang B,Xiao YF,et al.Helicobacter pylori upregulates Nanog and Oct4 via Wnt/β-catenin signaling pathway to promote cancer stem cell-like properties in human gastric cancer[J].Cancer Lett,2016,374(2):292-303.doi:10.1016/j.canlet.2016.02.032.

[20] Xiao X,Wang W,Wang Z.The role of chemotherapy for metastatic,relapsed and refractory osteosarcoma[J].Paediatr Drugs,2014,16(6):503-512.doi:10.1007/s40272-014-0095-z.

[21] Zhang Q,Bai X,Chen W,et al.Wnt/β-catenin signaling enhances hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via crosstalk with hif-1α signaling[J].Carcinogenesis,2013,34(5):962-973.doi:10.1093/carcin/bgt027.

[22] Paige SL,Osugi T,Afanasiev OK,et al.Endogenous Wnt/β-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells[J].PloS One,2010,5(6):e11134.doi:10.1371/journal.pone.0011134.

[23] Kavitha K,Kowshik J,Kishore TK,et al.Astaxanthin inhibits NF-κB and Wnt/β-catenin signaling pathways via inactivation of Erk/MAPK and PI3K/Akt to induce intrinsic apoptosis in a hamster model of oral cancer[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(10):4433-4444.doi:10.1016/j.bbagen.2013.05.032.

[24] Ji Q,Liu X,Fu X,et al.Resveratrol inhibits invasion and metastasis of colorectal cancer cells via MALAT1 mediated Wnt/β-catenin signal pathway[J].PloS One,2013,8(11):e78700.doi:10.1371/journal.pone.0078700.