，， ， ，

[陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所眼科，重慶 400042]

低頻脈沖超聲是一種使用頻率和劑量較低的超聲波，其頻率范圍一般在20 kHz～1 MHz。近來，隨著對(duì)低強(qiáng)度脈沖研究的深入，其生物學(xué)效應(yīng)已在臨床上得到初步應(yīng)用，比如低頻超聲的溶栓作用、促進(jìn)骨折愈合等[1-2]。低頻脈沖超聲對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用也不斷被發(fā)現(xiàn)[3]，其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理學(xué)及病理學(xué)的影響逐漸受到人們的重視。近期，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低頻超聲能夠?qū)σ蛩ダ纤碌暮ｑR神經(jīng)元退行性變起到保護(hù)作用[4]。但低頻脈沖超聲是否對(duì)正常生理狀態(tài)下海馬的神經(jīng)活動(dòng)產(chǎn)生直接作用及機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。本研究擬在觀察低頻脈沖超聲對(duì)小鼠海馬區(qū)形態(tài)學(xué)的改變以及所導(dǎo)致的曠場(chǎng)行為學(xué)的變化，進(jìn)一步探討這種改變背后的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)C57/BL6小鼠，體質(zhì)量(21±2)g，6～8周齡，雄性，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 醫(yī)用超聲耦合劑購自天津成信醫(yī)用輔助材料廠，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、山羊抗鼠免疫組化試劑盒、山羊抗兔免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，抗DCX抗體購自英國abcam公司，抗GFAP購自美國Merck Millipore公司，抗Iba1抗體購自美日本wako公司，抗GAPDH抗體購自美國sigma公司。

1.1.3 主要儀器 低頻超聲治療儀由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所設(shè)計(jì)研發(fā)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)(OF)購自上海移數(shù)科技有限公司，Western blot電泳及濕轉(zhuǎn)設(shè)備購自Biorad公司，光學(xué)顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低頻強(qiáng)度脈沖超聲處理小鼠大腦的模型建立 選取成年C57小鼠32只，隨機(jī)分為Sham組(16只)和LIPUS組(16只)。4.3%水合氯醛腹腔注射(0.01 mL/g)麻醉，用刀片剔除小鼠頭頂部毛發(fā)并在裸露皮膚處均勻涂抹超聲耦合劑，將超聲探頭置于小鼠頭頂，注意探頭表面需要和皮膚緊密貼合(圖1)。Sham組僅放置探頭10 min，不給予超聲刺激；LIPUS組采用2檔低頻脈沖超聲(平均功率密度為150 mW/cm2)處理10 min后。處理完成后，將小鼠置于溫暖環(huán)境復(fù)蘇。按上述方法，每日處置2次，持續(xù)7 d后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，維持小鼠體溫在35～37 ℃。

圖1 低頻脈沖超聲處理小鼠大腦

1.2.2 小鼠大腦冰凍切片及免疫組織化學(xué) 每組隨機(jī)取5只小鼠，4.3%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，開胸經(jīng)左心室插管，剪開右心耳，0.9%氯化鈉注射液快速灌注以沖凈血液后，4%多聚甲醛先快后慢灌注固定全身，斷頭取腦，4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜后，將大腦置于30%蔗糖中置換，待標(biāo)本沉底后，制作冰凍切片。矢狀面連續(xù)切片以觀察海馬，切片厚度為25 μm，每只鼠取部位切面相近的兩張切片進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化過程按中杉金橋免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：免疫組化過程中以0.02 mol/L PBS代替一抗孵育切片。采用ImageJ軟件對(duì)40倍目鏡視野內(nèi)的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)測(cè)算突起末端數(shù)目，用突起末端數(shù)目/陽性細(xì)胞數(shù)代表單個(gè)細(xì)胞平均突起數(shù)目。

1.2.3 小鼠海馬蛋白提取及蛋白免疫印跡 每組隨機(jī)取3只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，立即斷頭取腦置于冰上，冰上分離海馬組織，每只小鼠的海馬組織單獨(dú)置于一離心管中，充分冰上研磨，超聲1 min，12 000 r/min 4 ℃離心，取上清置于新的離心管中，按體積加入相應(yīng)蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min。每只小鼠蛋白樣本單獨(dú)用一個(gè)電泳道，凝膠電泳70 V分離，300 mA濕轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；滴加相應(yīng)二抗(1∶5 000)，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 曠場(chǎng)行為測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)開始前確認(rèn)OF裝置清潔、無味。每組取8只小鼠，提前運(yùn)送到行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境3 h。將小鼠從籠內(nèi)取出，放置在OF裝置中央，打開錄像系統(tǒng)，記錄小鼠在OF內(nèi)的活動(dòng)，總時(shí)間5 min。每批次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)裝置，并用紙巾擦干，涼置5 min后再進(jìn)行下一批次實(shí)驗(yàn)。用鼠博士數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行運(yùn)動(dòng)軌跡分析。

2 結(jié)果

2.1 低頻脈沖超聲刺激后，海馬中DCX、GFAP和Iba1蛋白的表達(dá)情況

蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示，2組DCX、GFAP和Iba1蛋白均呈陽性表達(dá)。2組間DCX及GFAP的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DCX相對(duì)表達(dá)量分別為(0.94±0.11)、(0.81±0.06)，GFAP相對(duì)表達(dá)量分別為(0.99±0.54)、(1.03±0.01)。但LIPUS組Iba1的相對(duì)表達(dá)量(0.94±0.05)明顯高于Sham組(0.60±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.2 小鼠海馬區(qū)免疫組織化學(xué)改變

2.2.1 DCX免疫組織化學(xué) 采用DCX標(biāo)記海馬齒回的神經(jīng)前體細(xì)胞，結(jié)果顯示鏡下可見緊密排列、成簇出現(xiàn)的DCX陽性細(xì)胞。這些細(xì)胞大多位于顆粒細(xì)胞層與門區(qū)之間。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)Sham組(33.33±2.40)個(gè)/視野與LIPUS組(32.00±2.08)個(gè)/視野，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3a、b。

2.2.2 GFAP免疫組織化學(xué) GFAP用以標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞陽性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)深棕色顆粒。

a：蛋白免疫印跡條帶；b：DCX的相對(duì)表達(dá)量；c：GAPD的相對(duì)表達(dá)量；d：Iba1的相對(duì)表達(dá)量 *：P<0.05)

圖2小鼠海馬中目的蛋白表達(dá)量

Sham組和LIPUS組中GFAP陽性細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞突起呈星形。同時(shí)，在200倍視野下，數(shù)量上Sham組(67.33±6.00)個(gè)/視野和LIPUS組(68.67±2.73)個(gè)/視野，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3c、d。

2.2.3 Iba1免疫組織化學(xué) 小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1在Sham組中數(shù)量為(31.33±2.03)個(gè)/視野，胞體較薄，周圍有大量樹枝狀突起，為未活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。部分小膠質(zhì)細(xì)胞突起較短，胞體增大。在LIPUS組中，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為(53.33±7.21)個(gè)/視野，與Sham組比較明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，胞體較大，兩者在單個(gè)細(xì)胞突起數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分別為(3.77±0.98)個(gè)/細(xì)胞，(3.52±0.11)個(gè)/細(xì)胞(圖3e、f，圖4)。但LIPUS組平均胞體面積為(139.68±38.12)μm2，明顯大于Sham組的(112.79±29.82)μm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4e。

a、c、e：Sham組小鼠海馬區(qū)免疫組化染色，按順序依次為DCX、GFAP、Iba1；b、d、f：LIPUS組小鼠海馬區(qū)免疫組化染色，按順序依次為DCX、GFAP、Iba1

圖3小鼠海馬區(qū)目的蛋白表達(dá)(a、b×400，c、d、e、f×200)

a、b：分別為Sham組、LIPUS組海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色(×600)；c：Iba1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)；d：?jiǎn)蝹€(gè)Iba1陽性細(xì)胞平均突起數(shù)目;e:單個(gè)Iba1陽性細(xì)胞平均胞體面積 *：P<0.05

圖4小鼠Iba1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及陽性細(xì)胞平均突起數(shù)目

2.3 小鼠曠場(chǎng)行為的變化

LIPUS組在OF中5 min活動(dòng)總路程為(1 602.79±134.77)cm，Sham組總路程為(1 486.15±247.03)cm，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩者在OF中的平均速度分別為(5.34±0.45)cm/s、(4.95±0.82)cm/s(P>0.05)。而LIPUS組中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間(38.01±10.54)s，顯著長(zhǎng)于Sham組(20.57±5.35)s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組小鼠的中央?yún)^(qū)域活動(dòng)路程分別為L(zhǎng)IPUS組(231.90±55.20)cm，Sham組(149.16±13.52)cm，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

a：Sham組活動(dòng)路徑；b：LIPUS組活動(dòng)路徑；c：活動(dòng)總路程；d：平均速度；e：中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間；f：中央?yún)^(qū)域活動(dòng)路程 *：P<0.05

3 討論

超聲波用于臨床診斷已有40多年的歷史，其安全性和準(zhǔn)確性已得到臨床驗(yàn)證。隨著對(duì)超聲研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)低頻超聲因具有在組織中易穿透、聲能吸收少、對(duì)組織損傷小的優(yōu)點(diǎn)，其在疾病治療方面的優(yōu)勢(shì)也日益凸顯。以往對(duì)低頻超聲生物學(xué)作用的研究主要集中在軟組織[5]、骨組織[6]、外周神經(jīng)[7]和腫瘤細(xì)胞[8]上。但實(shí)際上，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低頻超聲對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)活動(dòng)也有明確的調(diào)控作用[9]，比如低頻聚焦超聲波(LIFU)不僅可以激發(fā)或抑制大腦皮層的特定活動(dòng)，也可以引起血氧水平依賴信號(hào)的明顯變化[10]。近期，研究人員發(fā)現(xiàn)將LIFU直接作用于腦部特定區(qū)域能增強(qiáng)人們對(duì)觸覺的分辨能力。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)第一次證明了LIFU能調(diào)節(jié)人類腦活動(dòng)[11]。隨后，Lin等[12]發(fā)現(xiàn)不僅僅是聚焦超聲，低頻脈沖超聲也可通過上調(diào)海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的水平從而在大鼠阿爾茲海默模型導(dǎo)致的腦損傷中起到保護(hù)作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，不僅僅是在病理?xiàng)l件下，低頻脈沖超聲也可以對(duì)正常成年小鼠大腦產(chǎn)生刺激作用。在低頻脈沖超聲處理小鼠大腦7 d后，雖然未見星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的明顯變化，但免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示LIPUS組海馬區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞相較于Sham組明顯增多，同時(shí)，蛋白免疫印跡結(jié)果也支持了上述發(fā)現(xiàn)。

小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量占中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，廣泛分布于各個(gè)腦區(qū)，是腦內(nèi)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要免疫效應(yīng)器，起免疫監(jiān)視作用。但現(xiàn)今研究認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞的作用不僅限于免疫監(jiān)視作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，極化后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞占主導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出更明顯的焦慮情緒[13]。同時(shí)，大量研究也證實(shí)未激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在正常大腦中積極地監(jiān)視神經(jīng)元，有選擇的進(jìn)行突觸修剪，保持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，維持正常情緒狀態(tài)[14-16]。而在我們的實(shí)驗(yàn)中，LIPUS組在低頻脈沖超聲的刺激下，通過對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞平均突起數(shù)目的分析，2組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并且免疫組化Iba1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)上也無明顯差異，大多數(shù)均處于未激活的狀態(tài)。說明低頻脈沖超聲雖然刺激了海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，但是并未引起小膠質(zhì)細(xì)胞的明顯激活。Parkhurst等[17]報(bào)道，小膠質(zhì)細(xì)胞可通過分泌BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)學(xué)習(xí)相關(guān)突觸的形成，進(jìn)而在突觸可塑性的形成和學(xué)習(xí)能力的產(chǎn)生中起到重要作用。結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)低頻脈沖超聲刺激海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增多，從而引發(fā)了小鼠曠場(chǎng)行為的改變。Tang等[18]發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的增加會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)源性的BDNF增加，這也在一定程度上支持了我們的推測(cè)。但他們認(rèn)為是一種稱做神經(jīng)營養(yǎng)型(neurotrophic)小膠質(zhì)細(xì)胞的增加會(huì)促進(jìn)小膠質(zhì)源性的BDNF增加，這種類型的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為較大的胞體和較短的突起。而在Sham組和LIPUS組中我們都觀察到了這種形態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞，通過對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積的測(cè)量發(fā)現(xiàn)LIPUS組中小膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積顯著大于Sham組，我們認(rèn)為低頻脈沖超聲刺激導(dǎo)致了小鼠海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的增加。

本研究中，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示表現(xiàn)小鼠自發(fā)活動(dòng)的總路程和平均速度兩項(xiàng)指標(biāo)在2組中未見明顯變化，提示小鼠自發(fā)活動(dòng)無明顯差異。然而因小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潛在危險(xiǎn)的場(chǎng)所，故其具有“貼墻”活動(dòng)的天性[19]。在LIPUS組中，小鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間及中央?yún)^(qū)活動(dòng)路程的得分均明顯高于Sham組，提示低頻脈沖超聲超聲處理使得小鼠的趨避性和焦慮水平較Sham組小鼠明顯降低，也可以說，LIPUS組的小鼠更具“冒險(xiǎn)”傾向。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，參與包含條件性驚恐反應(yīng)在內(nèi)的情景學(xué)習(xí)。現(xiàn)階段研究認(rèn)為海馬功能與焦慮狀態(tài)的發(fā)生關(guān)系密切[20-22]。創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)作為焦慮狀態(tài)的代表性疾病之一，其患者海馬較正常人明顯縮小，并伴隨著明顯的海馬功能障礙，比如研究發(fā)現(xiàn)在PTSD患者中，海馬皮質(zhì)的代謝就受到了明顯抑制[23]。Snyder等[24]發(fā)現(xiàn)，成年海馬神經(jīng)發(fā)生受限的小鼠焦慮和抑郁樣行為明顯增加。而Mohammad等[25]則證實(shí)促進(jìn)成年海馬神經(jīng)發(fā)生可以有效降低小鼠的焦慮癥狀，提高小鼠在行為學(xué)測(cè)試中的表現(xiàn)。與此同時(shí)，近期研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之所以能夠緩和焦慮狀態(tài)也是因?yàn)榇碳ち撕ｑR區(qū)BDNF的表達(dá)上調(diào)[26]。因此，我們推測(cè)小鼠的曠場(chǎng)行為改變可能是由于海馬區(qū)增殖的神經(jīng)營養(yǎng)型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌BDNF所致。

綜上，我們認(rèn)為低頻脈沖超聲可以通過上調(diào)海馬區(qū)小膠質(zhì)的數(shù)目，從而導(dǎo)致小鼠焦慮水平的下降。但低頻超聲的作用機(jī)制復(fù)雜，究竟是小膠質(zhì)細(xì)胞分泌BDNF增加還是多種因素共同對(duì)小鼠的焦慮狀態(tài)產(chǎn)生了影響，尚需要進(jìn)一步深入研究。

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