劉貴喜，李家兵,2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000;2.綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院，四川綿陽(yáng) 621000)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有高復(fù)發(fā)率、死亡率，近年來(lái)世界范圍內(nèi)確診病例數(shù)提高了1.5倍，死亡率上升了1.3倍[1]；在我國(guó)膀胱癌發(fā)病率逐年增加[2]。環(huán)境因素和遺傳因素等多種因素參與了膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的功能與機(jī)體抗腫瘤免疫聯(lián)系密切，而細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)主要在人類活化的T細(xì)胞表面發(fā)揮生物學(xué)作用[3]。CTLA-4基因位于染色體2q33上，表達(dá)產(chǎn)物為白細(xì)胞表面抗原CD152，其與CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體B7-1/B7-2，負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖與活化，降低機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而增加腫瘤的易感性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymerphisms，SNPs)可從不同表達(dá)環(huán)節(jié)影響CTLA-4基因的表達(dá)，與肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的遺傳易感性存在密切聯(lián)系[5];同時(shí)也有極少數(shù)國(guó)外研究顯示與膀胱癌存在相關(guān)性[6];關(guān)于CTLA-4基因多態(tài)性與四川東北部地區(qū)漢族人群膀胱癌的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究旨在分析CTLA-4 CT60G/A、-1661A/G基因多態(tài)位點(diǎn)在膀胱癌的分布，探討CTLA-4基因多態(tài)性與膀胱癌之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象采集2015年5月至2017年6月綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院、四川省人民醫(yī)院、川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院等醫(yī)院收治入院且病理確診的初發(fā)膀胱癌患者241例，排除有血液性或其它自身免疫性疾病和腫瘤疾病病史患者。隨機(jī)選取326例同期各醫(yī)院健康體檢者為對(duì)照組，均無(wú)肉眼血尿、鏡下血尿，排除惡性腫瘤、血液或其他自身免疫性疾病史患者。兩組研究對(duì)象均屬于長(zhǎng)期居住在四川東北部地區(qū)的漢族人群，在民族、性別、年齡、居住地相匹配。本研究獲西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，臨床資料及標(biāo)本采集均獲所有研究對(duì)象均知情同意。兩組基線資料比較，兩組間性別、年齡分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；吸煙、飲酒分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001,表1、表2)。

年齡采用Student’s t test；性別、吸煙情況、飲酒情況采用卡方檢驗(yàn)。

1.2研究方法

1.2.1外周血DNA提取 采集每位研究對(duì)象約4 mL空腹靜脈血到放入含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的抗凝管中，采集血液后立即上下輕輕顛倒抗凝管8次以搖勻。用全血基因組小量抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取全血DNA，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，分類標(biāo)記置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

表2 病例組膀胱癌分期分級(jí)及轉(zhuǎn)移情況 [例(%)]

注：低級(jí)別組：由尿路上皮乳頭狀癌低級(jí)別和低度惡性潛能尿路上皮乳頭狀瘤組成；NMIBC：非肌層浸潤(rùn)性膀肌癌(pTa-pTl)；MIBC：肌層浸潤(rùn)性膀肌癌(pT2-pT4)。

1.2.2檢測(cè)提取DNA的濃度與純度 采用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA的濃度和純度的鑒定，讀取并記錄DNA在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸光值與A值，提取的DNA在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處吸光值的比值于1.7～2.1之間，純度合格。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng) 根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)CTLA-4 CT60G/A、-1661A/G位點(diǎn)的序列(分別為rs3087243，rs4553808)，并采用Premier5.0結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物。PCR引物序列由上海生工生物有限公司合成，引物序列為CT60G/A:正向?yàn)?′-TGG TCG TTT TCC GGA GTT GTC-3′,反向?yàn)?′-GGT TGC CAA CAT TGG GGT TG-3′,-1661A/G:正向?yàn)?′-CTA AGA GCA TCC GCT TGC ACC T-3′，反向?yàn)?′-TTG GTG TGA TGC ACA GAA GCC TTT T-3′。擴(kuò)增反應(yīng)總體系為10 μL，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94 ℃變性30 s，以58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度分別為394 bp和486 bp。產(chǎn)物通過(guò)120 mV、2.0%瓊脂糖凝膠下進(jìn)行電泳，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker)為參照觀察，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物分子量、有無(wú)特異性擴(kuò)增。

1.2.4限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法檢測(cè)CTLA-4 CT60G/A、-1661A/G位點(diǎn)的基因型 擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用限制性內(nèi)切酶HpyCH4 IV(CT60G/A)、內(nèi)切酶Msel(-1661A/G)進(jìn)行酶切，水浴2 h，取酶切產(chǎn)物5 μL上樣，并以DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)參照，于2%瓊脂糖120 V恒壓,40 min電泳分離，紫外光凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶。

1.2.5PCR-RFLP產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證 從標(biāo)本庫(kù)中分別隨機(jī)選取CTLA-4 CT60G/A、-1661A/G兩個(gè)位點(diǎn)3種不同的PCR-RFLP分型結(jié)果的標(biāo)本各20例，將PCR產(chǎn)物標(biāo)注好相應(yīng)信息后送上海生工公司進(jìn)行DNA測(cè)序確認(rèn)，其測(cè)序結(jié)果與PCR-RFLP分型結(jié)果一致。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，各組之間的基因型差異以χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以非條件logistic回歸分析統(tǒng)計(jì)不同遺傳模型與膀胱癌易感性及臨床特征的關(guān)系，結(jié)果以比值比(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)表示，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因檢測(cè)結(jié)果及PCT-RFLP酶切電泳圖片圖1～圖4。

圖1CTLA-4CT60G/A多態(tài)位點(diǎn)PCT-RFLP酶切電泳圖

1、2、4、6：GG型(244 bp+150 bp)；3：AG型(394 bp+244 bp+150 bp)；5：AA型(394 bp)。

圖2CTLA-4-1661A/G多態(tài)位點(diǎn)PCT-RFLP酶切電泳圖

1、2、3、4、7、9：AA型(347 bp+139 bp)；5、6：AG型(486 bp+347 bp+139 bp)；8：GG型(486 bp)。

圖3 CTLA-4 CT60G/A 的3種基因型

圖4 CTLA-4-1661A/G 的3種基因型

2.2遺傳平衡檢驗(yàn)對(duì)照組采用擬合度χ2檢驗(yàn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，P>0.05，對(duì)照組人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有人群代表性。

2.3CTLA-4CT60G/A、-1661A/G基因型分布CT60G/A位點(diǎn)基因型頻率在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.74,P=0.013),等位基因頻率在兩組的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.783,P=0.095)。-1661A/G位點(diǎn)基因型頻率在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.689,P=0.021),等位基因頻率在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.360,P=0.007，表3)。

2.4CT60G/A、-1661A/G基因模型下logistic回歸分析CT60G/A基因位點(diǎn)：在對(duì)照組與病例組中進(jìn)行不同基因模型下的logistic回歸分析結(jié)果顯示(表4)：通過(guò)合并雜合子與突變型純合子，組成顯性基因模型，CT60G/A GG可使膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.239倍，OR(95%CI)為1.239(1.039，1.478)，P=0.017，校正混雜因素(如性別、年齡、飲酒以及吸煙等)后OR(95%CI)為1.289(1.065，1.559)，P=0.009。

-1661A/G基因位點(diǎn)：在對(duì)照組與病例組中進(jìn)行不同基因模型下的logistic回歸分析結(jié)果顯示(表5)：-1661A/G AG+GG可使膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.549倍，OR(95%CI)1.549(1.093～2.195)，P=0.014；校正混雜因素(如性別、年齡、飲酒以及吸煙等因素)后OR(95%CI)為1.696(1.162～2.474)，P=0.006。等位基因模型中，G等位基因與A等位基因相比可顯著增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR(95%CI)為1.506(1.119～2.027)，P=0.007。

2.5CT60G/A、-1661A/G基因多態(tài)性與膀胱癌臨床特征的關(guān)系按照膀胱癌的分級(jí)、分期、轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分組～采用非條件Logistic回歸分析，通過(guò)校正吸煙、飲酒、性別、年齡等因素。在CT60G/A基因位點(diǎn)病例組中，各個(gè)基因模型與膀胱癌臨床分級(jí)、分期、轉(zhuǎn)移之間無(wú)相關(guān)性，P值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在-1661A/G基因位點(diǎn)病例組中顯性模型AG/GG基因型分別與膀胱癌分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，OR、95%CI、P值分別為0.514(0.294～0.899)、P=0.02；0.415(0.212～0.812)、P=0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各基因模型與膀胱癌臨床分級(jí)、分期、轉(zhuǎn)移之間無(wú)相關(guān)性，P值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表6)。

表3 病例組與對(duì)照組等位基因頻率及基因型分布的比較 [例(%)]

表4CT60G/A病例組與對(duì)照組不同基因模型下的Logistic回歸分析

基因模型基因型病例組[n(%)]對(duì)照組[n(%)]OR(95%CI)P值校正OR(95%CI)Pa值共顯性模型GG167(69.29)194(59.51)11AA61(25.31)120(36.81)0.591(0.407～0.856)0.0050.510(0.340～0.765)0.001AG13(5.39)12(3.68)1.258(0.559～2.833)0.5791.761(0.743～4.175)0.199顯性模型AG+AA74(30.71)132(40.49)11GG167(69.29)194(59.51)1.239(1.039～1.478)0.0171.289(1.065～1.559)0.009隱性模型AA13(5.39)12(3.68)11GG+AG228(94.61)314(96.32)0.67(0.300～1.496)0.3290.464(0.198～1.089)0.078等位基因模型G395(81.95)508(77.91)11A87(18.05)144(22.09)1.287(0.9561.732)0.096

Pa值為校正混雜因素(性別、年齡、吸煙、飲酒)后的基因模型下的Logistic回歸分析。

表5-1661A/G病例組與對(duì)照組不同基因模型下的Logistic回歸分析

基因模型基因型病例組[n(%)]對(duì)照組[n(%)]OR(95%CI)P值校正OR(95%CI)Pa值共顯性模型GG12(4.98)7(2.15)11AA143(59.34)226(69.32)0.369(0.142～0.960)0.0410.326(0.118～0.905)0.031AG86(35.68)93(28.53)0.539(0.203～1.433)0.2160.519(0.183～1.476)0.219顯性模型AA143(59.34)226(69.33)11AG+GG98(59.34)100(59.34)1.549(1.093～2.195)0.0141.696(1.162～2.474)0.006隱性模型AA+AG229(40.66)319(97.85)11GG12(4.98)7(2.15)1.545(0.962～2.482)0.0721.621(0.978～2.687)0.061等位基因模型A372(77.18)545(83.59)11G110(22.82)107(16.41)1.506(1.119～2.027)0.007

Pa值為校正混雜因素(性別、年齡、吸煙、飲酒)后的基因模型下的Logistic回歸分析。

表6分層分析-1661A/G基因多態(tài)性與膀胱癌的相關(guān)性

基因模型基因型低級(jí)別組/高級(jí)別組OR(95%CI)P值NMIBC/MIBCOR(95%CI)P值無(wú)轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)移OR(95%CI)P值共顯性模型GG111AA0.8(0.242～2.649)0.7153.512(0.742～16.617)0.1131.206(0.311～4.679)0.787AG0.641(0.186～2.202)0.481.935(0.395～9.488)0.4160.44(0.103～1.879)0.268顯性模型AA111AG+GG0.848(0.493～1.460)0.5530.514(0.294～0.899)0.020.415(0.212～812)0.01隱性模型AA+AG111GG1.165(0.646～2.100)0.6130.593(0.274～1.282)0.1841.065(0.544～2.084)0.858

NMIBC：非肌層浸潤(rùn)性膀肌癌(pTa-pTl)；MIBC：肌層浸潤(rùn)性膀肌癌(pT2-pT4)；低級(jí)別組由尿路上皮乳頭狀癌低級(jí)別和低度惡性潛能尿路上皮乳頭狀瘤組成。

3 討 論

膀胱癌發(fā)生發(fā)展與環(huán)境因素和遺傳因素密切相關(guān)。其中，腫瘤微環(huán)境中的免疫系統(tǒng)針對(duì)宿主對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)產(chǎn)生抑制，腫瘤細(xì)胞控制的抑制機(jī)制和宿主控制的免疫機(jī)制平衡被打破，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生或發(fā)展。腫瘤細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)因子而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫效應(yīng)，如調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性[7]。

研究表明通過(guò)T細(xì)胞表面CTLA-4異常聚集將導(dǎo)致T細(xì)胞抗腫瘤功能減低，其主要通過(guò)阻礙MHC與T細(xì)胞受體結(jié)合過(guò)程發(fā)揮作用[8]。CTLA-4分泌白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)兩種細(xì)胞因子，可分別通過(guò)降低CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+Th細(xì)胞生物學(xué)功能，直接抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[9]。CTLA-4通過(guò)介導(dǎo)不依賴Fas途徑的T細(xì)胞凋亡、抑制T細(xì)胞分化、降低白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)轉(zhuǎn)錄等方式抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及相關(guān)免疫反應(yīng)[10]，同時(shí)CTLA-4可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化周期停滯于G1或G0期，不向S期進(jìn)展，對(duì)T細(xì)胞活化周期的抑制直接導(dǎo)致T細(xì)胞活化功能顯著降低[11]，導(dǎo)致機(jī)體最終發(fā)生腫瘤或免疫性疾病。

CTLA-4負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能與腫瘤關(guān)系密切，目前諸多研究顯示CTLA-4基因存在多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，包括：CTLA-4+49G/A、-1661A/G、CT60 G/A、-318 T/C等多態(tài)性位點(diǎn)，其中CTLA-4 CT60 G/A、-1661A/G與多種腫瘤易感性相關(guān)。CTLA-4 CT60G/A位于CTLA-4基因3′UTR，其基因多態(tài)性導(dǎo)致CTLA-4蛋白表達(dá)過(guò)程中mRNA表達(dá)水平的差異。通常認(rèn)為sCTLA-4發(fā)揮抑制作用需通過(guò)與膜表面蛋白結(jié)合的形式與B7-mCTLA4競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合配體實(shí)現(xiàn)。sCTLA-4的水平降低，相對(duì)加強(qiáng)了B7-mCTLA4的作用，抑制T細(xì)胞活化，完成誘導(dǎo)了T細(xì)胞無(wú)能過(guò)程[12]。研究發(fā)現(xiàn)CT60 G/A位點(diǎn)G等位基因與可溶性CTLA-4(sCTLA-4)聯(lián)系密切，通過(guò)決定剪接作用效率和sCTLA-4 mRNA產(chǎn)量，調(diào)控sCTLA-4相對(duì)于全長(zhǎng)CTLA-4的量。GG基因型個(gè)體較AA基因型個(gè)體，sCTLA-4產(chǎn)量明顯減少。

本研究通過(guò)對(duì)CT60G/A不同基因模型下的Logistic回歸分析顯示：GG可使膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.239倍[OR(95%CI)為1.239(1.039，1.478)]，在等位基因模型中P=0.096，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與JAISWAL等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象的種族、數(shù)量、環(huán)境等有關(guān)，未來(lái)需進(jìn)一步多中心、大樣本的研究進(jìn)行驗(yàn)證；CTLA-4基因-1661A/G 病例組攜帶G等位基因較A等位基因顯著增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[OR(95%CI)為1.506(1.119,2.027)]。顯性模型中AG+GG可使膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.696倍OR(95%CI)為1.696(1.162，2.474)。CTLA-4-1661A/G位于CTLA-4基因啟動(dòng)子區(qū)，其等位基因的變異可能改變功能性DNA結(jié)合位點(diǎn)的堿基序列，從而影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的親和力，這對(duì)轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接的調(diào)節(jié)非常重要[13]。JIANG等[14]認(rèn)為-1661A/G G位點(diǎn)通過(guò)改變有關(guān)CTLA-4轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)上具有轉(zhuǎn)錄功能的結(jié)構(gòu)區(qū)域，導(dǎo)致CTLA-4的表達(dá)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。

我們的結(jié)果提示-1661 A/G位點(diǎn)與四川東北部地區(qū)漢族人群的膀胱癌易感性相關(guān)，CTLA-4 CT60G/A位點(diǎn)中，顯性模型下GG基因型增加罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)；在-1661 A/G位點(diǎn)的顯性模型下AG/GG基因型與膀胱癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，P值均<0.05,表明單核苷酸基因多態(tài)性不僅與腫瘤的遺傳易感性相關(guān)，同時(shí)也可能與腫瘤的臨床特征(分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移)相關(guān)，這一特點(diǎn)未來(lái)可能成為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展甚至預(yù)后的關(guān)鍵標(biāo)志指標(biāo)；同時(shí)，也進(jìn)一步證明了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與基因遺傳因素密切相關(guān)。本研究仍存在一定的局限性，所采集的研究對(duì)象均來(lái)自長(zhǎng)期居住在四川東北部地區(qū)的漢族人群，缺乏單核苷酸基因多態(tài)性與膀胱癌關(guān)系的具體作用機(jī)制，且國(guó)內(nèi)外研究中關(guān)于CTLA-4單核苷酸基因多態(tài)性與膀胱癌關(guān)系的具體作用機(jī)制不明確，故在遺傳因素與疾病的關(guān)系中，是否存在相互改變或先因后果的聯(lián)系，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，未來(lái)需要更大樣本量、多種族、多中心的臨床研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，更深入的探索遺傳因素與膀胱癌的具體作用機(jī)制，人類在諸多疾病與遺傳因素的研究中仍然任重而道遠(yuǎn)。

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