于季申，李 鵬，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163000）

在集約化養(yǎng)牛生產(chǎn)的條件下，牛呼吸系統(tǒng)疾病是一種典型的多因素性疾病。近年來，因呼吸障礙和系統(tǒng)衰竭死亡的牛犢占牛犢死亡總數(shù)居多，給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟損失。引起牛犢呼吸系統(tǒng)衰竭的病原很多，其中傳染性病原是導致牛犢高發(fā)病率和高死亡率的重要原因，為了防止疾病的進一步蔓延，需要對病原進行快速、準確的診斷。

牛克雷伯氏菌（Klebsiella）既是一種人獸共患病病原，又是一種條件性致病菌，可引起多種動物患病。該菌屬于腸桿菌科、克雷伯氏菌屬，為革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌[1-2]，牛肺炎克雷伯氏菌具有傳播范圍廣、速度快、死亡率高的特點，是目前公認的條件致病菌，牛肺炎克雷伯氏菌成暴發(fā)式流行，已有多起該細菌流行的養(yǎng)殖戶，可使人畜發(fā)生肺炎、子宮炎、泌尿道感染、化膿性腹膜炎及腹瀉，甚至發(fā)生敗血癥[3-4]，屬于人獸共患菌屬，且深得養(yǎng)殖戶日益關(guān)注[5]。

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）是曼氏桿菌屬的一個種，能引起牛、羊的肺炎、羊乳腺炎和新生羔羊急性敗血癥，具有全球分布性[6]。溶血性曼氏桿菌感染羊主要引起發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難，并引起肺部損傷[7-8]，與多殺性巴氏桿菌與許多相似臨床癥狀，例如全身皮下或臟器降魔局限性或點狀出血斑的敗血癥、炎性出血、呼吸困難、鼻鏡干裂、心跳呼吸加快、黏膜發(fā)紺、腹瀉等[9]。據(jù)統(tǒng)計，全球約30%的病死牛與其有關(guān)，每年給北美國家造成的經(jīng)濟損失超過10億美元[10]。由于存在呼吸道疾病癥狀，很容易與其他呼吸道疾病混淆，牛生長的各個階段都會感染和傳播此病，所以給許多養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

本試驗根據(jù)對大慶安達市某牛場送檢牛的流行病學調(diào)查、病理剖檢和實驗室診斷，確診其發(fā)病原因是該牛同時感染?？死撞暇腿苎月蠗U菌，牛群很容易因周圍生活環(huán)境的刺激（如長途運輸、過冷、過于擁擠、過熱、空氣干燥等）而使機體產(chǎn)生應激反應導致免疫抵抗力降低繼而誘發(fā)感染牛肺炎型克雷伯氏菌。該牛場飼養(yǎng)管理水平低，飼養(yǎng)密度大，飼料不科學；環(huán)境消毒不合格，排泄物沒有無害化處理；免疫程序混亂，沒有經(jīng)過科學的疫苗免疫程序，這些因素給病原提供大量繁殖并發(fā)生變異的機會，造成多種病原存在牛只體內(nèi)，當環(huán)境驟變時，牛體抵抗力下降，從而感染克雷伯氏菌牛溶血性曼氏桿菌于牛多殺性巴氏桿菌臨床癥狀極為相似，很難在解剖診斷過程中鑒別出來，該牛場可能多次診斷失誤沒有對癥下藥來治療溶血性曼氏桿菌，所以必要時要進行實驗室診斷來確保萬無一失，現(xiàn)將診斷過程匯報如下。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 大慶安達市地區(qū)某牛場送檢的病死犢牛，實驗室無菌采集牛的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟和腸，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗材料 DL 2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司。

1.3 引物設計 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的克雷伯氏菌（klebsiella）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、呼吸道合胞體（Respirator syncytial）、牛副流感（Bovine parainfluenza）、牛流行性腹瀉病毒（Bovine epidemic diarrhea virus）、牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis）、牛溶血性曼氏桿菌（Bovine hemolytic mansonibacillus）和牛支原體病毒（Mycoplasma bovine virus）的基因序列設計特異引物。見表1。

1.4 細菌分離培養(yǎng) 將各種病料通過無菌操作，接種于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察血液瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)；再挑取菌落進行革蘭氏染色，鏡檢時觀察菌體形態(tài)和染色特性。

1.5 核酸的提取與PPCCRR鑒定

1.5.1 組織DNA和RNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit操作進行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒進行提取RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增 按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA在-20℃進行保存?zhèn)溆?。用得到的DNA和cDNA為模板，牛肺炎型克雷伯氏菌、牛結(jié)合分枝桿菌、牛支原體病毒、牛多殺性巴氏桿菌和牛溶血性曼氏桿菌特異性引物進行PCR反應擴增，取10 μL的擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 藥敏試驗 將鑒定為克雷伯氏菌和溶血性曼氏桿菌混合感染的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（氟苯尼考、頭孢呋辛鈉、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、鹽酸林可霉素、氨芐西林鈉等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標準判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化 剖檢可見剖檢病死牛肺臟、肝臟腫大，表面有膠凍狀壞死灶，心包積液與肺部黏連，胃黏膜有嚴重潰瘍，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹，腎臟、膽囊腫大，心臟與肺部黏連、胸包積液。

表1 引物序列Table 1 Peimer sequence

圖1 胃黏膜嚴重潰瘍Fig.1 Severe gastric ulcer

圖2 肺臟腫大有壞死灶纖維素樣白色滲出物Fig.2 Lung swelling with cellulosic white exudates from the necrotic foci

圖3 心臟與肺部黏連，胸包積液Fig.3 Adhesion of the heart to the lungs,pleural effusion

圖4 腎臟、膽囊腫大Fig.4 Renal and gallbladder enlargement

2.2 涂片染色特性 將病料肺組織中所分離的細菌進行純培養(yǎng)，進行革蘭氏染色、涂片、鏡檢。可見到革蘭氏染色陰性菌，球狀或桿狀，呈單個、成對、短鏈狀排列，菌體周邊可見莢膜影（見圖5）。由于溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的形態(tài)及染色特征十分相似，所以為了區(qū)分這兩種細菌，又將無菌采集病死牛的肺臟、肝臟用平板劃線法涂抹于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察血液瓊脂培養(yǎng)基上菌落為圓形、邊緣整齊、表面光滑、扁平隆起、淡白色中等大小菌落（見圖6）。觀察到較大的灰白色黏液菌落，以接種環(huán)挑之，易拉成絲；再次進行革蘭氏染色鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)較短粗的桿菌，大小0.5～0.8 μm至2 μm，單獨，成雙或短鏈狀排列，無芽孢，無鞭毛的菌體；判定為革蘭氏陰性桿菌具有肺炎克雷伯氏菌形態(tài)特征（如圖7）。

圖5 革蘭氏陰性球狀桿狀、單個成對短鏈狀排列（10×10）Fig.5 A gram-negative,bulblike,single pair of short chain arrangement

圖6 5%兔血瓊脂培養(yǎng)基淡白色中等大小菌落Fig.6 5%rabbit blood agar medium light white medium size colony

圖7 革蘭氏陰性桿狀、較短粗單獨成雙或短鏈狀排列、無芽孢（10×10）Fig.7 Gram negative rod-shaped,with separate double short or short chains,ASPOROUS round colony pink,smooth

2.3 PPCCRR檢測結(jié)果 以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別選用克雷伯氏菌、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)合分枝桿菌、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒、牛流行性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛支原體病毒特異性引物進行PCR鑒定。其中第1孔在251 bp左右有一條條帶，與牛溶血性曼氏桿菌預期片段大小相符。其中2孔在501 bp左右有一條帶，與牛肺炎型克雷曼氏菌預期片段大小相符（如圖8）。

圖8 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.8 PCR electrophoresis analysis chart

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表2 藥敏結(jié)果Table 2 The results of drug susceptibility

3 討論

3.1 發(fā)病原因 對該牛場牛犢的發(fā)病原因進行調(diào)查：該牛場飼養(yǎng)管理水平低，飼養(yǎng)密度大，飼料不科學；環(huán)境消毒不合格，排泄物沒有無害化處理；免疫程序混亂，沒有經(jīng)過科學的疫苗免疫程序。這些因素給病原提供大量繁殖并發(fā)生變異的機會，造成多種病原存在牛只體內(nèi)，當環(huán)境驟變時，牛體抵抗力下降，病原侵入牛體造成嚴重損失。

3.2 防治措施 病死牛要進行無害化處理，被污染的圈舍、器具要進行消毒，糞便要進行堆積發(fā)酵處理，牛場環(huán)境要經(jīng)常消毒，疫情嚴重威脅時，消毒1次/d，連續(xù)消毒1周，以后夏天2次/周，冬天1次/周；牛舍凈化。在多數(shù)牛場尚無多點生產(chǎn)體系情況下，保育舍和育肥舍要作到單元式全進全出生產(chǎn)管理，即每個牛舍的用具、人員等要獨立，用具不可共用，人員不要來往[10-11]。要加強護理，一旦發(fā)現(xiàn)病牛最好隔離，單獨飼養(yǎng)，創(chuàng)造一個安靜舒適的環(huán)境，減少應激，有利于疾病的康復。

4 結(jié)論

通過對該病死豬的病理解剖和實驗室診斷，確診送檢的病死牛死亡原因是該牛感染了牛肺炎型克雷伯氏菌和牛溶血性曼氏桿菌，牛溶血性曼氏桿菌與牛多殺性巴氏桿菌臨床癥狀極為相似，很難在解剖診斷過程中鑒別出來[12]，該牛場可能多次診斷失誤，沒有對癥下藥，所以必要時要進行實驗室診斷來確保萬無一失，由于各牛場在治療牛病時習慣用的抗生素種類不盡相同，克雷伯氏菌會形成不同的耐藥性，各牛場在針對本病進行預防時應選用不同的抗生素[13]，不可生搬硬套。

[1] 侯相山，王洪水.豬肺炎克雷伯氏菌感染的診斷與防治[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2007，43（7）：74-74.

[2] 郝中香，廖紅，劉丹，等.扭角羚肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（1）：203-208.

[3] 高建新，盧兆蕓，涂俊凌，等.嬰幼兒配方乳粉中檢出肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種的報告[J].中國人獸共患病學報，2009，25（6）：611-612.

[4] 張志祥，吳文漢.56株粘質(zhì)沙雷菌的分布及其耐藥性分析[J]. 中國消毒學雜志，2013，30（12）：1134-1137.

[5] 韓猛立，康立超，鐘發(fā)剛，等.細菌性牛呼吸道疾病的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，（5）：165-172.

[6] 劉康軍，丁志國，李軍朝，等.三株羊溶血性曼氏桿菌的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，（5下）：120-121.

[7] 徐慧，賀云霞，葉飛，等.溶血性曼氏桿菌的分離與鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（12上）：97.

[8] 李娟，劉陽，彭欠欠，等.羊溶血性曼氏桿菌的分離鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013，（10下）：96-97.

[9] 倪宏波，何宏軒，喬軍.預防獸醫(yī)學檢驗技術(shù)[M].長春：吉林人民出版社，2002.

[10] REGGIEYC.Lo Genetic Analys is of Virulence Factors of Mannheimia(Pasteurella)Haemolytica A1[J].Veterinary Micro-biology,2001,83(1):23-35.

[11] BAI L,WU X,JIANG L,et al.Hydroge production by over-expression of hydrogenase subunit inoxygen-tolerant Kleb-siella oxytoca HP1[J].International journal of hydrogen ener-gy,2012,37(17):13227-13223.

[12] 張永久，王萍萍，武廣文.溶血性曼氏桿菌毒素的作用及其分子致病機理[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007，（7）：38-40.

[13] 吳丹丹，白云龍，李雪純，等.犢牛群發(fā)性肺炎鑒別診斷與藥敏實驗[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2016，28（6）：92-96.